Barth Sendromunun Hızlı Teşhisi için Lökositlerde Kardiyolipinin Kütle Spektrometresi ile Parmak İzi Alınması
Summary
Bu protokol, Barth sendromunun teşhisi için lökosit kardiyolipinin kütle spektrometrik “parmak izinin” nasıl elde edileceğini göstermektedir. Yüksek monolizokardiyolipin-kardiyolipin oranının değerlendirilmesi, Barth sendromlu hastaları %100 duyarlılık ve özgüllüğü olan kontrol kalp yetmezliği hastalarından ayırmaktadır.
Abstract
Yapısında dört yağ asidi zinciri taşıyan dimerik bir fosfolipid olan kardiyolipin (CL), mitokondrinin lipit belirtecidir ve burada iç zarın işleyişinde çok önemli bir rol oynar. Metaboliti monolizokardiyolipin (MLCL), hayvan hücrelerinin lipit ekstraktında fizyolojik olarak neredeyse yoktur ve görünümü, bebeklik döneminde ciddi kardiyomiyopatiye neden olan nadir ve sıklıkla yanlış teşhis edilen bir genetik hastalık olan Barth sendromunun (BTHS) ayırt edici özelliğidir. Burada açıklanan yöntem bir “kardiyolipin parmak izi” oluşturur ve hücresel lipit profillerinde CL ve MLCL türlerinin göreceli seviyelerinin basit bir analizine izin verir. Lökositler söz konusu olduğunda, matris yardımlı lazer desorpsiyon iyonizasyonu – uçuş süresi / kütle spektrometrisi ( MALDI-TOF / MS) yoluyla MLCL / CL oranını ölçmek için sadece 1 mL kan gerekir. Tahlil basittir ve BTHS’yi taramak için bir klinik biyokimya laboratuvarının rutin çalışmalarına kolayca entegre edilebilir. Test, BTHS için% 100 duyarlılık ve özgüllük gösterir ve bu da onu uygun bir tanı testi haline getirir.
Introduction
Barth sendromu (BTH), erken başlangıçlı kardiyomiyopati, iskelet kası miyopatisi, büyüme gecikmesi, nötropeni, değişken mitokondriyal solunum zinciri disfonksiyonu ve anormal mitokondriyal yapı 1,2,3,4,5 ile karakterize nadir görülen X’e bağlı bir hastalıktır. BTHS, şu anda dünya çapında bilinen 250’den az vaka ile milyon erkek başına bir vaka prevalansına sahiptir, ancak hastalığın 2,6 tanısının az olduğu yaygın olarak kabul edilmektedir. BTHS, Xq28.127,8 kromozomuna lokalize olan Tafazzin (TAFAZZIN) geninin fonksiyon kaybı mutasyonlarından kaynaklanır ve mitokondriyal fosfolipid kardiyolipinin (CL) eksik yeniden şekillenmesine neden olur, bu da normalde oldukça simetrik ve doymamış bir açil bileşimine yol açan bir süreç 9,10’dur. CL, oksidatif fosforilasyon (yani mitokondriyal enerji metabolizması), süperkompleks oluşumu, protein ithalatı için hayati önem taşıyan ve mitokondriyal dinamikler, mitofaji ve apoptoz 11,12,13,14,15,16 için hayati önem taşıyan iç zarın önemli bir bileşeni olduğu mitokondrinin imza lipiti olarak kabul edilmiştir. . TAFAZZIN’in fonksiyon kaybı üzerine, CL yeniden şekillenmesi başarısız olur ve BTHS hastalarının mitokondrilerinde spesifik fosfolipid anormallikleri ortaya çıkar: olgun CL seviyesi (CLm) azalırken, monolizokardiyolipin (MLCL) ve değişmiş CL açil bileşimi (yani, olgunlaşmamış CL türleri, CLi) düzeylerinde artış meydana gelir. Bu, MLCL / CL oranının17’sinde çarpıcı bir artışa neden olur.
BTHS tanısı genellikle zordur, çünkü bozukluk son derece değişken klinik ve biyokimyasal özellikler gösterir ve aynı aileden etkilenen bireyler arasında ve zaman içinde bir hasta içinde farklılık gösterebilir 3,5. Birçok BTHS erkek çocuğu, 3-metilglutakonik asidin (3-MGCA) idrar atılımının çok yüksek bir seviyesini gösterir, ancak idrar seviyesi normal olabilir veya zamanla hastalarda sadece hafif bir şekilde artabilir3. Bununla birlikte, artmış 3-MGCA, 3-metilglutakonil-CoA hidrataz eksikliği (AUH defekti), 3-metilglutakonik asidüri, distoni-sağırlık, ensefalopati, Leigh benzeri (MEGDEL) sendromu, Costeff sendromu ve ataksi (DCMA) sendromu ile dilate kardiyomiyopati gibi diğer çeşitli mitokondriyal ve mitokondriyal olmayan bozuklukların bir özelliğidir18,19 . Bu nedenle, BTHS için bir belirteç olarak 3-MCGA’nın zayıf özgüllüğü ve hastalardaki muazzam değişkenlik, biyokimyasal tanıyı belirsiz hale getirmektedir.
Ayrıca,bozukluğa neden olan 120’den fazla farklı TAFAZZIN mutasyonu tanımlanmıştır 5 ve bu nedenle genetik tanı karmaşık, yavaş ve pahalı olabilir. Ayrıca, TAFAZZIN geninin moleküler analizi, kodlamayan veya düzenleyen dizilerdeki mutasyonların varlığında yanlış negatif sonuçlara yol açabilir3. BTHS, (monolizo-) CL türlerinin nispi miktarları ve dağılımı belirlenerek açık bir şekilde test edilebilir ve TAFAZZIN gen dizilimi ile doğrulanabilir veya bunun tersi de geçerlidir.
Tanı için pratik bir test, MLCL / CL oranının Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ve Elektro Sprey İyonizasyon / Kütle spektrometrisi (ESI / MS) analizi ile kan noktası20,21’de ölçülmesidir. Bazı hastalarda normale yakın CL düzeyleri olduğu halde MLCL/CL oranı değiştiği için CL düzeyinin ölçülmesi tek başına tanı için yeterli değildir. Bu nedenle MLCL/CL oranının ölçümü BTHS tanısı için %100 duyarlılık ve özgüllüğe sahiptir21. HPLC ve ESI/MS analizine dayanan bir başka doğrulanmış yöntem lökositler22 üzerinde kurulmuştur, ancak daha önce ekstrakte edilen lipitlerin ayrılması için karmaşık kromatografik teknikler ve cihazların pahalılığı bu analizi birkaç klinik laboratuvarla sınırlandırmaktadır. Tüm bu faktörler, basit bir tanı testinin eksikliği ile birlikte, durumun yetersiz teşhisine katkıda bulunmuştur.
MALDI-TOF/MS, lipid analizinde23,24 bir başka geçerli araçtır. Bu analitik teknik, çeşitli biyolojik örneklerin lipit profillerini doğrudan elde etmek için kullanılabilir, böylece MS Görüntüleme uygulamaları için doku kesitleri de dahil olmak üzere ekstraksiyon ve ayırma adımları25,26,27,28,29 atlanır 30. Bu avantaj göz önüne alındığında, MALDI-TOF / MS ile sağlam lökositlerde mitokondriyal CL’nin profilini çıkararak BTHS’yi teşhis etmek için basit ve hızlı bir yöntem geliştirilmiştir28. Eritrosit sedimantasyonu ve lizis ile sadece 1 mL tam kandan lökosit izolasyonu basittir ve özel ekipman veya reaktif gerektirmez. Ayrıca, küçük miktarlarda lökositlere uygulanan hızlı bir lipit “mini ekstraksiyon” protokolü, bozulmamış lökositlerden elde edilenlerden daha yüksek sinyal-gürültü oranına (S / N) sahip daha temiz MS sinyallerine sahip spektrumların başarılı bir şekilde elde edilmesini garanti etmek için tanımlanmıştır28. Bu ileri adım çok az zaman alır ve analizlerin zayıf hassasiyete sahip MS cihazlarında gerçekleştirildiğinde bile tekrarlanabilir olmasını sağlar. Özetle, burada açıklanan analitik yöntem minimum numune hazırlama gerektirir, çünkü zaman alıcı ve emek yoğun kromatografik lipit ayrımı atlanabilir, böylece test hızlandırılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Barth sendromu, doğuştan gelen bir metabolizma hatası ve 2,6’nın az teşhis edilmesi muhtemel olan yaşamı değiştiren bir durumdur. Daha önce de belirtildiği gibi, katkıda bulunan bir faktör, basit bir tanı testinin olmaması olabilir. Burada, BTHS taraması için lökositlerde MLCL / CL oranını MALDI-TOF / MS ile ölçmek için basit ve hızlı bir yöntem tanımlanmıştır. Ayrıca, MALDI-TOF kütle spektrometreleri dünya çapında klinik l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
BTHS’li bireylere ve ailelerine araştırmamıza katıldıkları için minnettarız. Barth Sendromu Vakfı ABD ve Barth Sendromu İngiltere Vakfı’na destekleri ve Bristol’deki yıllık toplantıda kan örneklerinin toplanmasına yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Barth Sendromu Vakfı ABD, Barth Italia Onlus ve Apulia Bölgesi tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,1′2,2′-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 710335 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 878130 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate | Avanti Polar Lipids | 830845 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) | Avanti Polar Lipids | 840445 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840033 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 2-Propanol, ACS reagent, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 190764 | |
| 9-Aminoacridine hemihydrate, 98% | Acros Organics | 134410010 | |
| Acetonitrile, ACS reagent, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 360457 | |
| Chloroform, ACS reagent, ≥99.8% | Merck Life Science S.r.l. | 319988 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000 | Merck Life Science S.r.l. | 31392 | |
| Flex Analysis 3.3 | Bruker Daltonics | Software | |
| MALDI-TOF mass spectrometer Microflex LRF | Bruker Daltonics | ||
| Microsoft Excel | Microsoft Office | Software | |
| OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate | Merck Life Science S.r.l. | 6505-OP | |
| Potassium chloride, ACS reagent, 99.0-100.5% | Merck Life Science S.r.l. | P3911 | |
| Sodium chloride, ACS reagent, ≥99.0% | Merck Life Science S.r.l. | S9888 |
References
- Barth, P. G., et al. X-linked cardioskeletal myopathy and neutropenia (Barth syndrome): respiratory-chain abnormalities in cultured fibroblasts. Journal of Inherited Metabolic Disease. 19 (2), 157-160 (1996).
- Steward, C. G., et al. syndrome (X linked cardiac and skeletal myopathy, neutropenia, and organic aciduria): rarely recognised, frequently fatal [abstract]. Archives of Disease in Childhood. 89, 48 (2004).
- Clarke, S. L. N., et al. Barth syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases. 8, 23 (2013).
- Zegallai, H. M., Hatch, G. M. Barth syndrome: cardiolipin, cellular pathophysiology, management, and novel therapeutic targets. Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (3), 1605-1629 (2021).
- Taylor, C., et al. Clinical presentation and natural history of Barth Syndrome: An overview. Journal of Inherited Metabolic Disease. 45 (1), 7-16 (2022).
- Miller, P. C., Ren, M., Schlame, M., Toth, M. J., Phoon, C. A. Bayesian analysis to determine the prevalence of Barth syndrome in the pediatric population. The Journal of Pediatrics. 217, 139-144 (2020).
- Bione, S., et al. A novel X-linked gene, G4.5. is responsible for Barth syndrome. Nature Genetics. 12 (4), 385-389 (1996).
- Whited, K., Baile, M. G., Currier, P., Claypool, S. M. Seven functional classes of Barth Syndrome mutation. Human Molecular Genetics. 22 (3), 483-492 (2013).
- Schlame, M., Ren, M., Xu, Y., Greenberg, M. L., Haller, I. Molecular symmetry in mitochondrial cardiolipins. Chemistry and Physics of Lipids. 138 (1-2), 38-49 (2005).
- Schlame, M., Xu, Y. The function of Tafazzin, a mitochondrial phospholipid-lysophospholipid acyltransferase. Journal of Molecular Biology. 432 (18), 5043-5051 (2020).
- Schlame, M., Rua, D., Greenberg, M. L. The biosynthesis and functional role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 39 (3), 257-288 (2000).
- Mileykovskaya, E., Dowhan, W. Cardiolipin membrane domains in prokaryotes and eukaryotes. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (10), 2084-2091 (2009).
- Claypool, S. M., Koehler, C. M. The complexity of cardiolipin in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 37 (1), 32-41 (2011).
- Ren, M., Phoon, C. K., Schlame, M. Metabolism and function of mitochondrial cardiolipin. Progress in Lipid Research. 55, 1-16 (2014).
- Paradies, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M., Petrosillo, G. Role of cardiolipin in mitochondrial function and dynamics in health and disease: Molecular and pharmacological aspects. Cells. 8 (7), 728 (2019).
- Acoba, M. G., Senoo, N., Claypool, S. M. Phospholipid ebb and flow makes mitochondria go. The Journal of Cell Biology. 219 (8), 03131 (2020).
- Schlame, M., et al. Phospholipid abnormalities in children with Barth syndrome. Journal of the American College of Cardiology. 42 (11), 1994-1999 (2003).
- Wortmann, S. B., et al. Inborn errors of metabolism with 3-methylglutaconic aciduria as discriminative feature: proper classification and nomenclature. Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (6), 923-928 (2013).
- Ikon, N., Ryan, R. O. On the origin of 3-methylglutaconic acid in disorders of mitochondrial energy metabolism. Journal of Inherited Metabolic Disease. 39 (5), 749-756 (2016).
- Kulik, W., et al. Bloodspot assay using HPLC-tandem mass spectrometry for detection of Barth syndrome. Clinical Chemistry. 54 (2), 371-378 (2008).
- Vaz, F. M., et al. An improved functional assay in blood spot to diagnose Barth syndrome using the monolysocardiolipin/cardiolipin ratio. Journal of Inherited Metabolic Disease. 45 (1), 29-37 (2022).
- Bowron, A., et al. Diagnosis of Barth syndrome using a novel LC-MS/MS method for leukocyte cardiolipin analysis. Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (5), 741-746 (2013).
- Sun, G., et al. Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of cellular glycerophospholipids enabled by multiplexed solvent dependent analyte-matrix interactions. Analytical Chemistry. 80 (19), 7576-7585 (2008).
- Leopold, J., Popkova, Y., Engel, K. M., Schiller, J. Recent developments of useful MALDI matrices for the mass spectrometric characterization of lipids. Biomolecules. 8 (4), 173 (2018).
- Angelini, R., Babudri, F., Lobasso, S., Corcelli, A. MALDI-TOF/MS analysis of archaebacterial lipids in lyophilized membranes dry-mixed with 9-aminoacridine. The Journal of Lipid Research. 51 (9), 2818-2825 (2010).
- Angelini, R., et al. Lipidomics of intact mitochondria by MALDI-TOF MS. The Journal of Lipid Research. 53 (7), 1417-1425 (2012).
- Angelini, R., Vormieter, G., Corcelli, A., Fuchs, B. A fast method for the determination of PC/LPC ratio in intact horse serum by MALDI-TOF-MS: an easy-to-follow lipid biomarker of inflammation. Chemistry and Physics of Lipids. 183, 169-175 (2014).
- Angelini, R., et al. Cardiolipin fingerprinting of leukocytes by MALDI-TOF/MS as a screening tool for Barth syndrome. The Journal of Lipid Research. 56 (9), 1787-1794 (2015).
- Lobasso, S., et al. A lipidomic approach to identify potential biomarkers in exosomes from melanoma cells with different metastatic potential. Frontiers in Physiology. 12, 748895 (2021).
- Angelini, R., et al. Visualizing cholesterol in the brain by on-tissue derivatization and quantitative mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 93 (11), 4932-4949 (2021).
- Greco, V., et al. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical proteomics. Expert Review of Proteomics. 15 (8), 683-696 (2018).
- Duncan, M., DeMarco, M. L. MALDI-MS: Emerging roles in pathology and laboratory medicine. Clinical Mass Spectrometry (Del Mar, Calif). 13, 1-4 (2019).
