Cardiolipina de impressão digital em leucócitos por espectrometria de massa para um diagnóstico rápido da Síndrome de Barth

A síndrome de Barth (BTHS) é uma doença rara ligada a X caracterizada por cardiomiopatia precoce, miopatia muscular esquelética, atraso no crescimento, neutropenia, disfunção variável da cadeia respiratória mitocondrial e estrutura mitocondrial anormal 1,2,3,4,5. O BTHS tem uma prevalência de um caso por milhão de homens com atualmente menos de 250 casos conhecidos em todo o mundo, embora seja amplamente aceito que a doença seja subdiagnosmada ^2,6. O BTHS resulta de mutações de perda de função do gene Tafazzin (TAFAZZIN) localizado ao cromossomo Xq28.12 ^7,8 causando remodelação deficiente da cardiolipina fosfolipídida mitocondrial (CL), um processo que normalmente leva a uma composição de acilho altamente simétrica e insaturada ^9,10. A CL tem sido considerada a assinatura lipídica das mitocôndrias, onde é um importante constituinte da membrana interna, vital para fosforilação oxidativa (ou seja, metabolismo de energia mitocondrial), formação de supercomplexo, importação de proteínas e envolvido em dinâmica mitocondrial, mitofagia e apoptose 11,12,13,14, ^15,16 . Após a perda de função do TAFAZZIN, falhas de remodelação cl e anormalidades fosfolipíides específicas surgem em mitocôndrias de pacientes com BTHS: o nível de CL maduro (CLm) é diminuído, enquanto ocorrem níveis aumentados de monosocardiolipina (MLCL) e composição acilia alterada da CL (ou seja, espécies cl imaturas, CLi). Isso traz um aumento dramático da relação MLCL/CL¹⁷.

O diagnóstico de BTHS é muitas vezes difícil, pois o transtorno apresenta características clínicas e bioquímicas extremamente variáveis e pode diferir entre indivíduos afetados da mesma família e dentro de um paciente ao longo do tempo ^3,5. Muitos meninos BTHS mostram um nível muito alto de excreção urinária de ácido 3-metilglutrónico (3-MGCA), mas o nível de urina pode ser normal ou apenas levemente aumentado em pacientes ao longo do tempo³. No entanto, o aumento do 3-MGCA é uma característica de vários outros distúrbios mitocondriais e não mitocondriais, como deficiência de hidratação 3-metilglutaconyl-CoA (defeito de AUH), aciduria 3-metilglutacónica, dystonia-surdez, encefalopatia, síndrome de Leigh-like (MEGDEL), síndrome de Costeff e cardiomiopatia dilatada com síndrome de ataxia (DCMA)^18,19 . Assim, a baixa especificidade do 3-MCGA como marcador para o BTHS e a enorme variabilidade nos pacientes tornam ambíguo o diagnóstico bioquímico.

Além disso, mais de 120 mutações diferentes de TAFAZZIN foram descritas causando o transtorno⁵ e, portanto, um diagnóstico genético pode ser complicado, lento e caro. Além disso, a análise molecular do gene TAFAZZIN pode levar a resultados falso-negativos na presença de mutações em sequências não codificadoras ou reguladoras³. O BTHS pode ser inequivocamente testado determinando as quantidades relativas e distribuição de espécies (monolyso-)CL e confirmado pelo sequenciamento genético TAFAZZIN ou vice-versa.

Um teste prático para diagnóstico é a medição da razão MLCL/CL por Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) e Análise de Ionização de Spray Eletro / Espectrometria de Massa (ESI/MS) na mancha de sangue^20,21. A medição do nível de CL por si só não é adequada para o diagnóstico, pois alguns pacientes têm níveis quase normais de CL, mas alteraram a razão MLCL/CL. Portanto, a medição da razão MLCL/CL tem 100% de sensibilidade e especificidade para o diagnóstico de BTHS²¹. Outro método validado baseado na análise do HPLC e do ESI/MS foi criado nos leucócitos²², mas as complexas técnicas cromatográficas para separação de lipídios previamente extraídos e a disquete dos instrumentos restringem essa análise a alguns laboratórios clínicos. Todos esses fatores, juntamente com a falta de um teste diagnóstico simples, contribuíram para o subdiagnóstico da condição.

MALDI-TOF/MS é uma ferramenta mais válida na análise lipídica^23,24. Esta técnica analítica pode ser utilizada para obter diretamente perfis lipídes de várias amostras biológicas, pulando assim as etapas de extração e separação ^{25,26,27,28,29}, inclusive em seções de tecido para aplicações ^{de imagem em MS 30}. Dada essa vantagem, foi desenvolvido^um método simples e rápido para diagnosticar BTHS por meio de perfil de CL mitocondrial em leucócitos intactos com MALDI-TOF/MS. O isolamento leucócito de apenas 1 mL de sangue inteiro por sedimentação eritrócito é simples e não requer equipamentos especiais ou reagentes. Além disso, um protocolo rápido de “mini-extração” lipídide aplicável a quantidades minúsculas de leucócitos foi descrito para justificar a aquisição bem sucedida de espectros com sinais de MS mais limpos com uma maior relação sinal-ruído (S/N) do que naqueles obtidos de leucócitos intactos²⁸. Este passo adicional leva pouco tempo e permite que as análises sejam reprodutíveis mesmo quando realizadas em instrumentos de ESM com baixa sensibilidade. Em resumo, o método analítico aqui descrito requer uma preparação mínima da amostra, pois a separação cromatográfica cromatgráfica demorada e intensiva em mão-de-obra pode ser ignorada, acelerando assim o teste.