بصمات الكارديوليبين في الكريات البيض عن طريق قياس الطيف الكتلي للتشخيص السريع لمتلازمة بارث
Summary
يوضح هذا البروتوكول كيفية الحصول على “بصمة” طيفية كتلة من الكريات البيض كارديوليبين لتشخيص متلازمة بارث. تقييم ارتفاع نسبة أحادي السول ثنائي الكارديوليبين إلى الكارديوليبين يميز المرضى الذين يعانون من متلازمة بارث من السيطرة على مرضى قصور القلب الذين يعانون من حساسية وخصوصية 100٪.
Abstract
Cardiolipin (CL) ، وهو فوسفوليبيد ثنائي يحمل أربع سلاسل من الأحماض الدهنية في هيكله ، هو علامة الدهون للميتوكوندريا ، حيث يلعب دورا حاسما في عمل الغشاء الداخلي. مستقلبه أحادي السوروكارديوليبين (MLCL) غائب تقريبا من الناحية الفسيولوجية في مستخلص الدهون للخلايا الحيوانية ومظهره هو السمة المميزة لمتلازمة بارث (BTHS) ، وهو مرض وراثي نادر وغالبا ما يتم تشخيصه بشكل خاطئ ويسبب اعتلال عضلة القلب الحاد في مرحلة الطفولة. الطريقة الموصوفة هنا تولد “بصمة كارديوليبين” وتسمح بإجراء فحص بسيط للمستويات النسبية لأنواع CL و MLCL في ملفات تعريف الدهون الخلوية. في حالة الكريات البيض ، هناك حاجة إلى 1 مل فقط من الدم لقياس نسبة MLCL / CL عن طريق تأين الامتزاز بالليزر بمساعدة المصفوفة – وقت الطيران / قياس الطيف الكتلي (MALDI-TOF / MS) في غضون 2 ساعة فقط من سحب الدم. الفحص مباشر ويمكن دمجه بسهولة في العمل الروتيني لمختبر الكيمياء الحيوية السريرية لفحص BTHS. يظهر الاختبار حساسية وخصوصية بنسبة 100٪ ل BTHS ، مما يجعله اختبارا تشخيصيا مناسبا.
Introduction
متلازمة بارث (BTHS) هو مرض نادر مرتبط ب X يتميز باعتلال عضلة القلب المبكر ، واعتلال عضلة العضلات الهيكلية ، وتأخر النمو ، وقلة العدلات ، وخلل سلسلة الجهاز التنفسي المتغير للميتوكوندريا ، وبنية الميتوكوندريا غير الطبيعية1،2،3،4،5. ينتشر مرض BTHS حالة واحدة لكل مليون ذكر مع أقل من 250 حالة معروفة حاليا في جميع أنحاء العالم ، على الرغم من أنه من المقبول على نطاق واسع أن المرض غير مشخص بشكل كاف 2,6. ينتج BTHS عن طفرات فقدان الوظيفة لجين Tafazzin (TAFAZZIN) المترجمة إلى كروموسوم Xq28.127,8 مما يسبب إعادة تشكيل ناقصة للكارديوليبين الفوسفوليبيد الميتوكوندريا (CL) ، وهي عملية تؤدي عادة إلى تكوين أسيل متماثل للغاية وغير مشبع 9,10. يعتبر CL الدهون المميزة للميتوكوندريا ، حيث يعد مكونا مهما للغشاء الداخلي ، وهو حيوي للفسفرة التأكسدية (أي استقلاب طاقة الميتوكوندريا) ، وتكوين المركب الفائق ، واستيراد البروتين ، ويشارك في ديناميكيات الميتوكوندريا ، و mitophagy ، وموت الخلايا المبرمج11،12،13،14،15،16 . عند فقدان TAFAZZIN للوظيفة ، تفشل إعادة تشكيل CL وتنشأ تشوهات فوسفوليبيد محددة في الميتوكوندريا لمرضى BTHS: يتم تقليل مستوى CL الناضج (CLm) ، في حين تحدث مستويات متزايدة من monolysocardiolipin (MLCL) وتغيير تكوين CL acyl (أي أنواع CL غير الناضجة ، CLi). هذا يؤدي إلى زيادة كبيرة في نسبة MLCL / CL17.
غالبا ما يكون تشخيص BTHS صعبا ، حيث يقدم الاضطراب ميزات سريرية وكيميائية حيوية متغيرة للغاية وقد يختلف بين الأفراد المصابين من نفس العائلة وداخل المريض بمرور الوقت 3,5. يظهر العديد من الأولاد BTHS مستوى عال جدا من إفراز البول من حمض 3-methylglutaconic (3-MGCA) ، ولكن قد يكون مستوى البول طبيعيا أو يزداد بشكل طفيف فقط في المرضى بمرور الوقت3. ومع ذلك ، فإن زيادة 3-MGCA هي سمة من سمات العديد من اضطرابات الميتوكوندريا الأخرى وغير الميتوكوندريا ، مثل نقص الهيدراتيز 3-methylglutaconyl-CoA (عيب AUH) ، وحمض 3-methylglutaconic ، وخلل التوتر العضلي ، واعتلال الدماغ ، ومتلازمة Leigh-like (MEGDEL) ، ومتلازمة Costeff ، واعتلال عضلة القلب الموسع مع متلازمة الرنح (DCMA)18,19 . وبالتالي ، فإن ضعف خصوصية 3-MCGA كعلامة ل BTHS والتباين الهائل في المرضى يجعل التشخيص الكيميائي الحيوي غامضا.
علاوة على ذلك ، تم وصف أكثر من 120 طفرة TAFAZZIN مختلفة تسبب الاضطراب5 ، وبالتالي ، يمكن أن يكون التشخيص الوراثي معقدا وبطيئا ومكلفا. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي التحليل الجزيئي لجين TAFAZZIN إلى نتائج سلبية كاذبة في وجود طفرات في تسلسلات غير مشفرة أو منظمة3. يمكن اختبار BTHS بشكل لا لبس فيه عن طريق تحديد الكميات النسبية وتوزيع أنواع CL (monolyso-) وتأكيدها عن طريق تسلسل جين TAFAZZIN أو العكس.
الاختبار العملي للتشخيص هو قياس نسبة MLCL / CL بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) وتحليل التأين الكهربائي بالرش / قياس الطيف الكتلي (ESI / MS) في بقعة الدم20,21. قياس مستوى CL وحده غير كاف للتشخيص لأن بعض المرضى لديهم مستويات شبه طبيعية من CL ولكن نسبة MLCL / CL متغيرة. لذلك ، فإن قياس نسبة MLCL / CL له حساسية وخصوصية 100٪ لتشخيص BTHS21. تم إعداد طريقة أخرى تم التحقق من صحتها تعتمد على تحليل HPLC و ESI / MS على الكريات البيض22 ، لكن التقنيات الكروماتوغرافية المعقدة لفصل الدهون المستخرجة سابقا وتكلفة الأدوات تقيد هذا التحليل لعدد قليل من المختبرات السريرية. كل هذه العوامل ، إلى جانب عدم وجود اختبار تشخيصي مباشر ، ساهمت في نقص تشخيص الحالة.
MALDI-TOF / MS هي أداة صالحة أخرى في تحليل الدهون23,24. يمكن استخدام هذه التقنية التحليلية للحصول مباشرة على ملفات تعريف الدهون لمختلف العينات البيولوجية ، وبالتالي تخطي خطوات الاستخراج والفصل25،26،27،28،29 ، بما في ذلك في أقسام الأنسجة لتطبيقات التصوير MS30. بالنظر إلى هذه الميزة ، تم تطوير طريقة بسيطة وسريعة لتشخيص BTHS عن طريق تنميط الميتوكوندريا CL في الكريات البيض السليمة مع MALDI-TOF / MS28. عزل الكريات البيض من 1 مل فقط من الدم الكامل عن طريق ترسيب كريات الدم الحمراء وتحللها أمر بسيط ولا يتطلب معدات أو كواشف خاصة. وعلاوة على ذلك، تم وصف بروتوكول “الاستخراج المصغر” السريع للدهون المطبق على كميات دقيقة من الكريات البيض لتبرير النجاح في الحصول على أطياف تحتوي على إشارات MS أنظف مع نسبة إشارة إلى ضوضاء أعلى (S/N) مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها من الكريات البيضالسليمة 28. تستغرق هذه الخطوة الإضافية القليل من الوقت وتسمح بأن تكون التحليلات قابلة للتكرار حتى عند تنفيذها على أجهزة MS ذات الحساسية الضعيفة. باختصار ، تتطلب الطريقة التحليلية الموضحة هنا الحد الأدنى من إعداد العينات لأنه يمكن تخطي فصل الدهون الكروماتوغرافي الذي يستغرق وقتا طويلا وكثافة في العمالة ، وبالتالي تسريع الاختبار.
Protocol
Representative Results
Discussion
متلازمة بارث هي خطأ فطري في التمثيل الغذائي وحالة تغير الحياة من المرجح أن يتم تشخيصها بشكل أقلمن 2,6. كما ذكرنا من قبل ، قد يكون العامل المساهم هو عدم وجود اختبار تشخيصي مباشر. هنا ، تم وصف طريقة بسيطة وسريعة لقياس نسبة MLCL / CL بواسطة MALDI-TOF / MS في الكريات البيض…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون للأفراد الذين لديهم BTHS وعائلاتهم للمشاركة في بحثنا. نشكر مؤسسة متلازمة بارث في الولايات المتحدة وصندوق متلازمة بارث في المملكة المتحدة على دعمهما ومساعدتهما في جمع عينات الدم في الاجتماع السنوي في بريستول. تم تمويل هذه الدراسة من قبل مؤسسة متلازمة بارث الأمريكية ، بارث إيطاليا أونلوس ، ومنطقة بوليا.
Materials
| 1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,1′2,2′-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 710335 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 878130 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate | Avanti Polar Lipids | 830845 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) | Avanti Polar Lipids | 840445 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840033 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 2-Propanol, ACS reagent, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 190764 | |
| 9-Aminoacridine hemihydrate, 98% | Acros Organics | 134410010 | |
| Acetonitrile, ACS reagent, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 360457 | |
| Chloroform, ACS reagent, ≥99.8% | Merck Life Science S.r.l. | 319988 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000 | Merck Life Science S.r.l. | 31392 | |
| Flex Analysis 3.3 | Bruker Daltonics | Software | |
| MALDI-TOF mass spectrometer Microflex LRF | Bruker Daltonics | ||
| Microsoft Excel | Microsoft Office | Software | |
| OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate | Merck Life Science S.r.l. | 6505-OP | |
| Potassium chloride, ACS reagent, 99.0-100.5% | Merck Life Science S.r.l. | P3911 | |
| Sodium chloride, ACS reagent, ≥99.0% | Merck Life Science S.r.l. | S9888 |
References
- Barth, P. G., et al. X-linked cardioskeletal myopathy and neutropenia (Barth syndrome): respiratory-chain abnormalities in cultured fibroblasts. Journal of Inherited Metabolic Disease. 19 (2), 157-160 (1996).
- Steward, C. G., et al. syndrome (X linked cardiac and skeletal myopathy, neutropenia, and organic aciduria): rarely recognised, frequently fatal [abstract]. Archives of Disease in Childhood. 89, 48 (2004).
- Clarke, S. L. N., et al. Barth syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases. 8, 23 (2013).
- Zegallai, H. M., Hatch, G. M. Barth syndrome: cardiolipin, cellular pathophysiology, management, and novel therapeutic targets. Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (3), 1605-1629 (2021).
- Taylor, C., et al. Clinical presentation and natural history of Barth Syndrome: An overview. Journal of Inherited Metabolic Disease. 45 (1), 7-16 (2022).
- Miller, P. C., Ren, M., Schlame, M., Toth, M. J., Phoon, C. A. Bayesian analysis to determine the prevalence of Barth syndrome in the pediatric population. The Journal of Pediatrics. 217, 139-144 (2020).
- Bione, S., et al. A novel X-linked gene, G4.5. is responsible for Barth syndrome. Nature Genetics. 12 (4), 385-389 (1996).
- Whited, K., Baile, M. G., Currier, P., Claypool, S. M. Seven functional classes of Barth Syndrome mutation. Human Molecular Genetics. 22 (3), 483-492 (2013).
- Schlame, M., Ren, M., Xu, Y., Greenberg, M. L., Haller, I. Molecular symmetry in mitochondrial cardiolipins. Chemistry and Physics of Lipids. 138 (1-2), 38-49 (2005).
- Schlame, M., Xu, Y. The function of Tafazzin, a mitochondrial phospholipid-lysophospholipid acyltransferase. Journal of Molecular Biology. 432 (18), 5043-5051 (2020).
- Schlame, M., Rua, D., Greenberg, M. L. The biosynthesis and functional role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 39 (3), 257-288 (2000).
- Mileykovskaya, E., Dowhan, W. Cardiolipin membrane domains in prokaryotes and eukaryotes. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (10), 2084-2091 (2009).
- Claypool, S. M., Koehler, C. M. The complexity of cardiolipin in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 37 (1), 32-41 (2011).
- Ren, M., Phoon, C. K., Schlame, M. Metabolism and function of mitochondrial cardiolipin. Progress in Lipid Research. 55, 1-16 (2014).
- Paradies, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M., Petrosillo, G. Role of cardiolipin in mitochondrial function and dynamics in health and disease: Molecular and pharmacological aspects. Cells. 8 (7), 728 (2019).
- Acoba, M. G., Senoo, N., Claypool, S. M. Phospholipid ebb and flow makes mitochondria go. The Journal of Cell Biology. 219 (8), 03131 (2020).
- Schlame, M., et al. Phospholipid abnormalities in children with Barth syndrome. Journal of the American College of Cardiology. 42 (11), 1994-1999 (2003).
- Wortmann, S. B., et al. Inborn errors of metabolism with 3-methylglutaconic aciduria as discriminative feature: proper classification and nomenclature. Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (6), 923-928 (2013).
- Ikon, N., Ryan, R. O. On the origin of 3-methylglutaconic acid in disorders of mitochondrial energy metabolism. Journal of Inherited Metabolic Disease. 39 (5), 749-756 (2016).
- Kulik, W., et al. Bloodspot assay using HPLC-tandem mass spectrometry for detection of Barth syndrome. Clinical Chemistry. 54 (2), 371-378 (2008).
- Vaz, F. M., et al. An improved functional assay in blood spot to diagnose Barth syndrome using the monolysocardiolipin/cardiolipin ratio. Journal of Inherited Metabolic Disease. 45 (1), 29-37 (2022).
- Bowron, A., et al. Diagnosis of Barth syndrome using a novel LC-MS/MS method for leukocyte cardiolipin analysis. Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (5), 741-746 (2013).
- Sun, G., et al. Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of cellular glycerophospholipids enabled by multiplexed solvent dependent analyte-matrix interactions. Analytical Chemistry. 80 (19), 7576-7585 (2008).
- Leopold, J., Popkova, Y., Engel, K. M., Schiller, J. Recent developments of useful MALDI matrices for the mass spectrometric characterization of lipids. Biomolecules. 8 (4), 173 (2018).
- Angelini, R., Babudri, F., Lobasso, S., Corcelli, A. MALDI-TOF/MS analysis of archaebacterial lipids in lyophilized membranes dry-mixed with 9-aminoacridine. The Journal of Lipid Research. 51 (9), 2818-2825 (2010).
- Angelini, R., et al. Lipidomics of intact mitochondria by MALDI-TOF MS. The Journal of Lipid Research. 53 (7), 1417-1425 (2012).
- Angelini, R., Vormieter, G., Corcelli, A., Fuchs, B. A fast method for the determination of PC/LPC ratio in intact horse serum by MALDI-TOF-MS: an easy-to-follow lipid biomarker of inflammation. Chemistry and Physics of Lipids. 183, 169-175 (2014).
- Angelini, R., et al. Cardiolipin fingerprinting of leukocytes by MALDI-TOF/MS as a screening tool for Barth syndrome. The Journal of Lipid Research. 56 (9), 1787-1794 (2015).
- Lobasso, S., et al. A lipidomic approach to identify potential biomarkers in exosomes from melanoma cells with different metastatic potential. Frontiers in Physiology. 12, 748895 (2021).
- Angelini, R., et al. Visualizing cholesterol in the brain by on-tissue derivatization and quantitative mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 93 (11), 4932-4949 (2021).
- Greco, V., et al. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical proteomics. Expert Review of Proteomics. 15 (8), 683-696 (2018).
- Duncan, M., DeMarco, M. L. MALDI-MS: Emerging roles in pathology and laboratory medicine. Clinical Mass Spectrometry (Del Mar, Calif). 13, 1-4 (2019).
