Fingerprinting Cardiolipine in leukocyten door massaspectrometrie voor een snelle diagnose van het Barth-syndroom

Barth-syndroom (BTHS) is een zeldzame X-gebonden ziekte die wordt gekenmerkt door cardiomyopathie met vroege aanvang, myopathie van de skeletspieren, groeivertraging, neutropenie, variabele mitochondriale respiratoire ketendisfunctie en abnormale mitochondriale structuur 1,2,3,4,5. BTHS heeft een prevalentie van één geval per miljoen mannen met momenteel minder dan 250 bekende gevallen wereldwijd, hoewel het algemeen wordt aanvaard dat de ziekte ondergediagnosticeerd is ^2,6. BTHS is het gevolg van functieverliesmutaties van het Tafazzin (TAFAZZIN)-gen gelokaliseerd op chromosoom Xq28.12 ^7,8, waardoor een gebrekkige remodellering van het mitochondriale fosfolippide-cardiolipine (CL) ontstaat, een proces dat normaal gesproken leidt tot een zeer symmetrische en onverzadigde acylsamenstelling ^9,10. CL wordt beschouwd als het kenmerkende lipide van mitochondriën, waar het een belangrijk bestanddeel van het binnenmembraan is, van vitaal belang voor oxidatieve fosforylering (d.w.z. mitochondriaal energiemetabolisme), supercomplexvorming, eiwitimport en betrokken bij mitochondriale dynamica, mitofagie en apoptose 11,12,13,14,15,16 . Bij TAFAZZIN-functieverlies mislukt cl-remodellering en ontstaan specifieke fosfolipideafwijkingen in mitochondriën van BTHS-patiënten: het volwassen CL-niveau (CLm) is verlaagd, terwijl verhoogde niveaus van monolysocardiolipine (MLCL) en veranderde CL-acylsamenstelling (d.w.z. onrijpe CL-soorten, CLi) optreden. Dit brengt een dramatische stijging van de MLCL/CL-ratio^{17 met zich mee}.

De diagnose van BTHS is vaak moeilijk, omdat de aandoening extreem variabele klinische en biochemische kenmerken vertoont en in de loop van de tijd kan verschillen tussen getroffen personen uit dezelfde familie en binnen een patiënt ^3,5. Veel BTHS-jongens vertonen een zeer hoog niveau van uitscheiding van 3-methylglutaconzuur (3-MGCA) in de urine, maar het urineniveau kan normaal zijn of slechts licht verhoogd bij patiënten in de loop van de tijd³. Verhoogde 3-MGCA is echter een kenmerk van verschillende andere mitochondriale en niet-mitochondriale aandoeningen, zoals 3-methylglutaconyl-CoA hydratasedeficiëntie (AUH-defect), 3-methylglutaconzuuracidurie, dystonie-doofheid, encefalopathie, Leigh-achtig (MEGDEL) -syndroom, Costeff-syndroom en gedilateerde cardiomyopathie met ataxie (DCMA) -syndroom^18,19 . Vandaar dat de slechte specificiteit van 3-MCGA als marker voor BTHS en de enorme variabiliteit bij patiënten de biochemische diagnose dubbelzinnig maken.

Bovendien zijn er meer dan 120 verschillende TAFAZZIN-mutaties beschreven die de aandoening⁵ veroorzaken en daarom kan een genetische diagnose ingewikkeld, traag en duur zijn. Bovendien kan moleculaire analyse van het TAFAZZIN-gen leiden tot vals-negatieve resultaten in de aanwezigheid van mutaties in niet-coderende of regulerende sequenties³. BTHS kan ondubbelzinnig worden getest door de relatieve hoeveelheden en verdeling van (monolyso-)CL-soorten te bepalen en bevestigd door TAFAZZIN-gensequencing of vice versa.

Een praktijktest voor diagnose is het meten van de MLCL/CL-verhouding door middel van High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) en Electro Spray Ionization / Mass spectrometry (ESI/MS) analyse in bloedvlek^20,21. Het meten van het CL-niveau alleen is niet voldoende voor de diagnose, omdat sommige patiënten bijna normale niveaus van CL hebben, maar een veranderde MLCL / CL-verhouding. Daarom heeft de meting van de MLCL/CL-ratio 100% sensitiviteit en specificiteit voor BTHS-diagnose²¹. Een andere gevalideerde methode op basis van HPLC- en ESI/MS-analyse is opgezet op leukocyten²², maar de complexe chromatografische technieken voor scheiding van eerder geëxtraheerde lipiden en de duurheid van de instrumenten beperken deze analyse tot enkele klinische laboratoria. Al deze factoren, samen met het ontbreken van een eenvoudige diagnostische test, hebben bijgedragen aan de onderdiagnose van de aandoening.

MALDI-TOF/MS is een ander geldig hulpmiddel in lipidenanalyse^23,24. Deze analytische techniek kan worden gebruikt om direct lipideprofielen van verschillende biologische monsters te verkrijgen, waardoor extractie- en scheidingsstappen 25,26,27,28,29 worden overgeslagen, inclusief in weefselsecties voor MS Imaging-toepassingen 30. Gezien dit voordeel werd een eenvoudige en snelle methode ontwikkeld om BTHS te diagnosticeren door mitochondriale CL in intacte leukocyten te profileren met MALDI-TOF/MS²⁸. Leukocytenisolatie van slechts 1 ml volbloed door erytrocytenbezinking en lysis is eenvoudig en vereist geen speciale apparatuur of reagentia. Bovendien werd een snel lipide “mini-extractie” protocol beschreven dat van toepassing is op minieme hoeveelheden leukocyten om de succesvolle verwerving van spectra met schonere MS-signalen met een hogere signaal-ruisverhouding (S / N) te rechtvaardigen dan in die verkregen uit intacte leukocyten²⁸. Deze verdere stap kost weinig tijd en zorgt ervoor dat analyses reproduceerbaar zijn, zelfs wanneer ze worden uitgevoerd op MS-instrumenten met een slechte gevoeligheid. Kortom, de hier beschreven analysemethode vereist minimale monstervoorbereiding omdat tijdrovende en arbeidsintensieve chromatografische lipidescheiding kan worden overgeslagen, waardoor de test wordt versneld.