Summary

Prise d’empreintes digitales de la cardiolipine dans les leucocytes par spectrométrie de masse pour un diagnostic rapide du syndrome de Barth

Published: March 23, 2022
doi:

Summary

Ce protocole montre comment obtenir une « empreinte » spectrométrique de masse de la cardiolipine leucocytaire pour le diagnostic du syndrome de Barth. L’évaluation du rapport élevé entre la monolysocardiolipine et la cardiolipine distingue les patients atteints du syndrome de Barth des patients témoins atteints d’insuffisance cardiaque avec une sensibilité et une spécificité de 100%.

Abstract

La cardiolipine (CL), un phospholipide dimérique portant quatre chaînes d’acides gras dans sa structure, est le marqueur lipidique des mitochondries, dans lequel elle joue un rôle crucial dans le fonctionnement de la membrane interne. Son métabolite monolysocardiolipine (MLCL) est physiologiquement presque absent dans l’extrait lipidique des cellules animales et son apparition est la marque du syndrome de Barth (BTHS), une maladie génétique rare et souvent mal diagnostiquée qui provoque une cardiomyopathie sévère dans la petite enfance. La méthode décrite ici génère une « empreinte cardiolipine » et permet un dosage simple des niveaux relatifs des espèces CL et MLCL dans les profils lipidiques cellulaires. Dans le cas des leucocytes, seulement 1 mL de sang est nécessaire pour mesurer le rapport MLCL/CL via l’ionisation de désorption laser assistée par matrice – spectrométrie temps de vol/spectrométrie de masse (MALDI-TOF/MS) juste à moins de 2 h du prélèvement sanguin. Le test est simple et peut être facilement intégré dans le travail de routine d’un laboratoire de biochimie clinique pour dépister le BTHS. Le test montre une sensibilité et une spécificité de 100% pour le BTHS, ce qui en fait un test de diagnostic approprié.

Introduction

Le syndrome de Barth (BTHS) est une maladie rare liée à l’X caractérisée par une cardiomyopathie précoce, une myopathie musculaire squelettique, un retard de croissance, une neutropénie, un dysfonctionnement variable de la chaîne respiratoire mitochondriale et une structure mitochondriale anormale 1,2,3,4,5. BTHS a une prévalence d’un cas par million d’hommes avec actuellement moins de 250 cas connus dans le monde, bien qu’il soit largement admis que la maladie est sous-diagnostiquée 2,6. BTHS résulte de mutations de perte de fonction du gène Tafazzin (TAFAZZIN) localisé sur le chromosome Xq28.12 7,8 provoquant un remodelage déficient de la cardiolipine phospholipide mitochondriale (CL), un processus qui conduit normalement à une composition acyle hautement symétrique et insaturée 9,10. Cl a été considéré comme le lipide signature des mitochondries, où il est un constituant important de la membrane interne, vital pour la phosphorylation oxydative (c’est-à-dire le métabolisme énergétique mitochondrial), la formation supercomplexe, l’importation de protéines et impliqué dans la dynamique mitochondriale, la mitophagie et l’apoptose 11,12,13,14,15,16 . Lors de la perte de fonction de TAFAZZIN, le remodelage de la CL échoue et des anomalies phospholipidiques spécifiques apparaissent dans les mitochondries des patients BTHS: le niveau de CL mature (CLm) est diminué, tandis que des niveaux accrus de monolysocardiolipine (MLCL) et une composition altérée de CL acyl (c’est-à-dire des espèces cl immatures, CLi) se produisent. Cela entraîne une augmentation spectaculaire du ratio MLCL/CL17.

Le diagnostic de BTHS est souvent difficile, car le trouble présente des caractéristiques cliniques et biochimiques extrêmement variables et peut différer entre les personnes touchées de la même famille et au sein d’un patient au fil du temps 3,5. De nombreux garçons BTHS montrent un niveau très élevé d’excrétion urinaire de l’acide 3-méthylglutaconique (3-MGCA), mais le niveau d’urine peut être normal ou seulement légèrement augmenté chez les patients au cours du temps3. Cependant, l’augmentation de la 3-MGCA est une caractéristique de divers autres troubles mitochondriaux et non mitochondriaux, tels que le déficit en 3-méthylglutaconyl-CoA hydratase (défaut AUH), l’acidurie 3-méthylglutaconique, la dystonie-surdité, l’encéphalopathie, le syndrome de Leigh-like (MEGDEL), le syndrome de Costeff et la cardiomyopathie dilatée avec syndrome d’ataxie (DCMA)18,19 . Par conséquent, la faible spécificité du 3-MCGA en tant que marqueur du BTHS et l’énorme variabilité chez les patients rendent le diagnostic biochimique ambigu.

De plus, plus de 120 mutations différentes de TAFAZZIN ont été décrites à l’origine du trouble5 et, par conséquent, un diagnostic génétique peut être compliqué, lent et coûteux. De plus, l’analyse moléculaire du gène TAFAZZIN peut conduire à des résultats faussement négatifs en présence de mutations dans des séquences non codantes ou régulatrices3. Le BTHS peut être testé sans ambiguïté en déterminant les quantités relatives et la distribution des espèces de (monolyso-)CL et confirmé par le séquençage du gène TAFAZZIN ou vice versa.

Un test pratique pour le diagnostic est la mesure du rapport MLCL / CL par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) et électro-pulvérisation ionisation / spectrométrie de masse (ESI / MS) analyse dans la tache de sang 20,21. La mesure du niveau de CL seul n’est pas adéquate pour le diagnostic car certains patients ont des niveaux presque normaux de CL mais un rapport MLCL / CL modifié. Par conséquent, la mesure du rapport MLCL/CL a une sensibilité et une spécificité de 100% pour le diagnostic BTHS21. Une autre méthode validée basée sur l’analyse HPLC et ESI/MS a été mise en place sur les leucocytes22, mais les techniques chromatographiques complexes de séparation des lipides précédemment extraits et le coût des instruments limitent cette analyse à quelques laboratoires cliniques. Tous ces facteurs, ainsi que l’absence d’un test de diagnostic simple, ont contribué au sous-diagnostic de la maladie.

MALDI-TOF/MS est un autre outil valable dans l’analyse des lipides23,24. Cette technique analytique peut être utilisée pour obtenir directement les profils lipidiques de divers échantillons biologiques, sautant ainsi les étapes d’extraction et de séparation 25,26,27,28,29, y compris dans les coupes de tissus pour les applications d’imagerie MS 30. Compte tenu de cet avantage, une méthode simple et rapide de diagnostic du BTHS par profilage de la CL mitochondriale dans des leucocytes intacts avec MALDI-TOF/MS a été développée28. L’isolement des leucocytes à partir de seulement 1 mL de sang total par sédimentation érythrocytaire et lyse est simple et ne nécessite pas d’équipement ou de réactifs spéciaux. De plus, un protocole de « mini-extraction » rapide des lipides applicable à des quantités infimes de leucocytes a été décrit comme justifiant l’acquisition réussie de spectres ayant des signaux MS plus propres avec un rapport signal/bruit (S/N) plus élevé que dans ceux obtenus à partir de leucocytes intacts28. Cette étape supplémentaire prend peu de temps et permet aux analyses d’être reproductibles même lorsqu’elles sont effectuées sur des instruments MS peu sensibles. En résumé, la méthode d’analyse décrite ici nécessite une préparation minimale de l’échantillon, car la séparation chromatographique des lipides, longue et laborieuse, peut être ignorée, accélérant ainsi le test.

Protocol

Des échantillons de sang de donneurs sains et de patients atteints d’insuffisance cardiaque ont été prélevés à l’hôpital policlinique de Bari (Italie), tandis que des échantillons de patients BTHS ont été prélevés par la clinique BTHS du National Health Service UK au Bristol Royal Hospital for Children (Royaume-Uni). Le consentement éclairé écrit des donneurs, des patients et des parents en bonne santé (le cas échéant) et les approbations des comités d’éthique respectifs ont été obtenus. <…

Representative Results

Dans cette étude, une méthode simple et rapide pour isoler les leucocytes de 1 mL de sang total et obtenir l’empreinte CL par MALDI-TOF/MS a été décrite (voir la figure 2). La figure 3 montre la comparaison des empreintes CL représentatives des leucocytes, obtenues chez des sujets témoins et de jeunes garçons BTHS, dans la gamme de masse CL et MLCL (m / z). Le tableau 1 énumère les espèces CL et MLCL détectées dans ces sp…

Discussion

Le syndrome de Barth est une erreur innée du métabolisme et une condition qui change la vie et qui est susceptible d’être sous-diagnostiquée 2,6. Comme mentionné précédemment, un facteur contributif peut être l’absence d’un test de diagnostic simple. Ici, une méthode simple et rapide pour mesurer le rapport MLCL/CL par MALDI-TOF/MS dans les leucocytes pour le dépistage du BTHS a été décrite. De plus, les spectromètres de masse MALDI-TOF s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous sommes reconnaissants aux personnes atteintes de BTHS et à leurs familles d’avoir participé à notre recherche. Nous remercions la Barth Syndrome Foundation US et le Barth Syndrome UK Trust pour leur soutien et pour leur aide à la collecte des échantillons de sang lors de la réunion annuelle à Bristol. Cette étude a été financée par Barth Syndrome Foundation US, Barth Italia Onlus et la région des Pouilles.

Materials

1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipin Avanti Polar Lipids 750332 Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,1′2,2′-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin Avanti Polar Lipids 710335 Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 878130 Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate Avanti Polar Lipids 830845 Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) Avanti Polar Lipids 840445 Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Avanti Polar Lipids 840033 Lipid standard for MALDI-TOF calibration
2-Propanol, ACS reagent, ≥99.5% Merck Life Science S.r.l. 190764
9-Aminoacridine hemihydrate, 98% Acros Organics 134410010
Acetonitrile, ACS reagent, ≥99.5% Merck Life Science S.r.l. 360457
Chloroform, ACS reagent, ≥99.8% Merck Life Science S.r.l. 319988
Dextran from Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000 Merck Life Science S.r.l. 31392
Flex Analysis 3.3 Bruker Daltonics Software
MALDI-TOF mass spectrometer Microflex LRF Bruker Daltonics
Microsoft Excel Microsoft Office Software
OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate Merck Life Science S.r.l. 6505-OP
Potassium chloride, ACS reagent, 99.0-100.5% Merck Life Science S.r.l. P3911
Sodium chloride, ACS reagent, ≥99.0% Merck Life Science S.r.l. S9888

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Cite This Article
Angelini, R., Russo, S., Corcelli, A., Lobasso, S. Fingerprinting Cardiolipin in Leukocytes by Mass Spectrometry for a Rapid Diagnosis of Barth Syndrome. J. Vis. Exp. (181), e63552, doi:10.3791/63552 (2022).

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