Fingerprinting Cardiolipin nei leucociti mediante spettrometria di massa per una diagnosi rapida della sindrome di Barth

La sindrome di Barth (BTHS) è una rara malattia legata all’X caratterizzata da cardiomiopatia ad esordio precoce, miopatia del muscolo scheletrico, ritardo della crescita, neutropenia, disfunzione variabile della catena respiratoria mitocondriale e struttura mitocondriale anormale 1,2,3,4,5. BTHS ha una prevalenza di un caso per milione di maschi con attualmente meno di 250 casi noti in tutto il mondo, anche se è ampiamente accettato che la malattia è sottodiagnosticata ^2,6. BTHS deriva da mutazioni per perdita di funzione del gene Tafazzin (TAFAZZIN) localizzate sul cromosoma Xq28.12 ^7,8 che causano un rimodellamento carente della cardiolipina fosfolipidica mitocondriale (CL), un processo che normalmente porta ad una composizione acilica altamente simmetrica e insatura ^9,10. La CL è stata considerata il lipide caratteristico dei mitocondri, dove è un importante costituente della membrana interna, vitale per la fosforilazione ossidativa (cioè il metabolismo energetico mitocondriale), la formazione di supercomplessi, l’importazione di proteine e coinvolto nella dinamica mitocondriale, nella mitofagia e nell’apoptosi 11,12,13,14,15,16 . In caso di perdita di funzione di TAFAZZIN, il rimodellamento della CL fallisce e si verificano anomalie specifiche dei fosfolipidi nei mitocondri dei pazienti con BTHS: il livello di CL maturo (CLm) è diminuito, mentre si verificano livelli aumentati di monolisocardiolipina (MLCL) e composizione acilica CL alterata (cioè specie di CL immature, CLi). Ciò comporta un drammatico aumento del rapporto MLCL/CL¹⁷.

La diagnosi di BTHS è spesso difficile, in quanto il disturbo presenta caratteristiche cliniche e biochimiche estremamente variabili e può differire tra gli individui affetti della stessa famiglia e all’interno di un paziente nel tempo ^3,5. Molti ragazzi BTHS mostrano un livello molto elevato di escrezione urinaria di acido 3-metilglutaconico (3-MGCA), ma il livello delle urine può essere normale o solo lievemente aumentato nei pazienti nel tempo³. Tuttavia, l’aumento della 3-MGCA è una caratteristica di vari altri disturbi mitocondriali e non mitocondriali, come il deficit di idratasi 3-metilglutaconil-CoA (difetto AUH), aciduria 3-metilglutaconica, distonia-sordità, encefalopatia, sindrome di Leigh-like (MEGDEL), sindrome di Costeff e cardiomiopatia dilatativa con atassia (DCMA)^{sindrome 18,19} . Quindi, la scarsa specificità del 3-MCGA come marcatore per BTHS e l’enorme variabilità nei pazienti rendono ambigua la diagnosi biochimica.

Inoltre, sono state descritte oltre 120 diverse mutazioni di TAFAZZIN che causano il disturbo⁵ e, pertanto, una diagnosi genetica può essere complicata, lenta e costosa. Inoltre, l’analisi molecolare del gene TAFAZZIN può portare a risultati falsi negativi in presenza di mutazioni in sequenze non codificanti o regolatrici³. I BTHS possono essere testati in modo inequivocabile determinando le quantità relative e la distribuzione delle specie (monolyso-)CL e confermati dal sequenziamento del gene TAFAZZIN o viceversa.

Un test pratico per la diagnosi è la misurazione del rapporto MLCL/CL mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e ionizzazione elettro-spray / spettrometria di massa (ESI/MS) nella macchia ematica^20,21. La misurazione del livello di CL da sola non è adeguata per la diagnosi in quanto alcuni pazienti hanno livelli quasi normali di CL ma un rapporto MLCL/CL alterato. Pertanto, la misurazione del rapporto MLCL/CL ha una sensibilità e una specificità del 100% per la diagnosi di BTHS²¹. Un altro metodo validato basato sull’analisi HPLC ed ESI/MS è stato messo a punto sui leucociti²², ma le complesse tecniche cromatografiche per la separazione dei lipidi precedentemente estratti e la costosità degli strumenti limitano questa analisi a pochi laboratori clinici. Tutti questi fattori, insieme alla mancanza di un test diagnostico diretto, hanno contribuito alla sottodiagnosi della condizione.

MALDI-TOF/MS è un ulteriore valido strumento nell’analisi lipidica^23,24. Questa tecnica analitica può essere utilizzata per ottenere direttamente profili lipidici di vari campioni biologici, saltando così le fasi di estrazione e separazione 25,26,27,28,29, anche nelle sezioni tissutali per applicazioni di MS Imaging³⁰. Dato questo vantaggio, è stato sviluppato un metodo semplice e veloce per diagnosticare la BTHS profilando la CL mitocondriale nei leucociti intatti con MALDI-TOF/MS²⁸. L’isolamento dei leucociti da solo 1 mL di sangue intero mediante eritrosedimentazione e lisi è semplice e non richiede attrezzature o reagenti speciali. Inoltre, è stato descritto un protocollo di “mini-estrazione” lipidica veloce applicabile a piccole quantità di leucociti per garantire il successo dell’acquisizione di spettri con segnali MS più puliti con un rapporto segnale-rumore (S / N) più elevato rispetto a quelli ottenuti da leucociti intatti²⁸. Questo ulteriore passo richiede poco tempo e consente di riprodurre le analisi anche se eseguite su strumenti MS con scarsa sensibilità. In sintesi, il metodo analitico qui descritto richiede una preparazione minima del campione perché la separazione dei lipidi cromatografici dispendiosa in termini di tempo e laboriosa può essere saltata, accelerando così il test.