DNA Fiber Testi Kullanılarak İnsan Hücrelerinde Replikasyon Sonrası Boşlukların Birikmesi ve Onarımının Tespiti

Seminal çalışmalar, bakteri¹ ve insan hücrelerinde ^DNA’ya zarar veren ajanlarla tedavi üzerine post-replikatif tek sarmallı (ssDNA) boşlukların biriktiğine dair kanıtlar sağlamıştır ^2,3. Hasarlı DNA şablonlarının replikasyonu sırasında, DNA sentez makinesi, spesifik translezyon sentezi DNA polimerazları kullanarak veya şablon anahtarlama mekanizmaları yoluyla lezyonları atlayabilir. Alternatif olarak, replizom daha sonra onarılmak üzere geride bir ssDNA boşluğu bırakarak lezyonu atlayabilir. Daha yakın zamanlarda, bir çalışma, genotoksik ajanlarla tedavinin, replikasyon ara ürünlerinin spesifik yapısını görselleştirmek için elektron mikroskobu kullanılarak ökaryotlarda ssDNA boşluklarına yol açtığını açıkça göstermiştir⁴. Post-replikatif boşlukların bu bölgelerinin oluşumunun başlangıçta DNA replikasyonu^2’nin yarı-süreksiz modunun basit bir sonucu olduğu öne sürüldü. Bu durumda, geciken iplikçik üzerindeki bir lezyon bir Okazaki parçasının uzamasını engelleyebilir, ancak çatal ilerlemesi doğal olarak bir ssDNA boşluğunun arkasında kalan aşağıdaki Okazaki parçası tarafından kurtarılır. Bununla birlikte, daha ileri çalışmalar, ilk olarak bakteri^5’te gösterildiği gibi, öncü iplikçik üzerinde boşluk oluşumunun da mümkün olduğunu göstermiştir. Ökaryotlarda, primaz aktivitesine sahip benzersiz bir DNA polimeraz olan PRIMPOL’ün, azarlama aktivitesi 6,7,8,9,10,11 yoluyla bir replikasyon bloke edici lezyonun DNA sentezini yeniden başlatabildiği gösterilmiştir. Bu nedenle, PRIMPOL primaz aktivitesi, insan hücrelerinde DNA’ya zarar veren bir ajanla tedavi edildiğinde önde gelen iplikçikte post-replikatif ssDNA boşluklarının oluşumunu açıklayabilir¹². Bununla birlikte, bu boşlukların tespiti ve boşluk onarımı, yakın zamana kadar, elektron mikroskobu⁴ veya plazmid bazlı tahliller¹³ gibi dolaylı veya zaman alıcı yaklaşımlar gerektiriyordu. İnsan hücrelerindeki boşlukları tespit etmek için ssDNA’ya özgü S1 nükleazın kullanılması, kırk yıldan daha uzun bir süre önce, sakkaroz gradyan teknikleri ^2,3 kullanılarak yapılan erken çalışmalarla öncülük etmiştir. Daha yakın zamanlarda, grubumuz DNA lifi ve kuyruklu yıldız tahlilleri¹⁴ gibi diğer yöntemleri kullanarak DNA’nın kopyalanmasında (post-replikatif boşluklar) ssDNA’yı tespit etmek için bu nükleazın kullanımını uyguladı. Bu yeni yaklaşımlar, replikatif sonrası boşluklar üzerine yapılan çalışmaların mevcut artışının yolunu açtı. Burada, DNA fiber testi ile replikatif ssDNA boşluklarını tespit etmek için S1 nükleaz kullanma stratejisini açıklıyoruz ve DNA fiber protokolündeki bir diferansiyel etiketleme şemasının bu boşlukların onarımının incelenmesine nasıl izin verebileceğini açıklıyoruz.

DNA lifi testi, giderek artan sayıda laboratuvar tarafından kullanılan ve replikasyon çatalı dinamikleri ve replikasyon stres tepki mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sağlayan güçlü bir tekniktir. Kısaca, bu teknik, nükleotid analoglarının (CldU -5-kloro-2′-deoksiüridin- ve IdU -5-iyodo-2′-deoksiüridin gibi) replikasyon DNA’sına sıralı olarak dahil edilmesine dayanmaktadır. Hasattan sonra, hücreler lize edilir ve DNA molekülleri pozitif kaplı bir cam slayt üzerine yayılır. CldU ve IdU daha sonra floresan mikroskopta iki renkli lifler olarak görselleştirilebilen spesifik antikorlar tarafından tespit edilir. Son olarak, IdU ve CldU yollarının uzunlukları, DNA hasarı indüksiyonunun bir sonucu olarak DNA replikasyon dinamiklerindeki herhangi bir değişikliği tanımlamak için ölçülür. Bu teknik, çatal durma, çatal yavaşlama, yeni ortaya çıkan DNA bozulması ve^15,16 orijin ateşleme sıklığındaki değişiklikler gibi farklı fenomenleri araştırmak için kullanılabilir.

DNA lifi testinin bir sınırlaması, birkaç kilobazın çözünürlüğüdür. Post-replikatif ssDNA boşlukları yüzlerce baz aralığında olabileceğinden, bu boşlukları doğrudan standart DNA fiber protokolü ile görselleştirmek imkansızdır. Genotoksik ajanlarla tedavi edilen insan hücrelerinde DNA’nın kopyalanmasında ssDNA boşluklarının varlığı daha önce dolaylı olarak ortaya çıkmıştır. Örneğin, ssDNA bağlayıcı proteinin, replikasyon proteini A’nın (RPA) S fazı dışındaki hücrelerde işe alınması veya alkali DNA çözülmesi ile tespit edilen ssDNA oluşumunun DNA lifi testi ile uzun süreli çatal durdurma yokluğu ile birlikte değerlendirildiği gibi ssDNA’nın gözlemlenmesi 12,17,18,19,20,21 ssDNA boşluklarının birikmesine bağlanmıştır. Ek olarak, post-replikatif ssDNA boşlukları, ATR’ye bağımlı bir G2 / M faz kontrol noktasını indükler ve replikasyon zehirleri 18,19,20,21,22 ile muamele edilmiş hücreleri durdurur^.

S1 nükleaz, 5′-fosforil mono- veya oligonükleotidleri serbest bırakan tek sarmallı nükleik asitleri bozar ve RNA’ya kıyasla ssDNA’ya 5 kat daha yüksek bir afiniteye sahiptir. Çift sarmallı nükleik asitler (DNA: DNA, DNA: RNA veya RNA: RNA), aşırı yüksek konsantrasyonlarda kullanıldığı durumlar dışında S1 nükleazına karşı dirençlidir. S1 nükleazı ayrıca bir çentik, boşluk, uyumsuzluk veya döngünün neden olduğu tek sarmallı bölgede çift sarmallı DNA’yı parçalar. Bu nedenle S1 nükleazı, ssDNA boşluklarını parçalayabilen ve sonuçta çift sarmallı kırılmalar üretebilen ^ssDNA’ya özgü bir endonükleazdır^23,24. Böylece, DNA fiber protokolüne S1 nükleaz sindirimi için adımlar eklenmesi, dolaylı olarak replikatif sonrası ssDNA boşluklarının tespit edilmesini sağlar. Boşlukların varlığında, DNA yayılmadan önce maruz kalan çekirdeklerin S1 nükleazı ile muamele edilmesi, doğal olarak boşluk^14’te bulunan ssDNA’nın S1 bölünmesinin bir sonucu olarak daha kısa yollar üretecektir. Buna göre, yol kısaltması, bu yaklaşımı kullanarak ssDNA boşlukları için okumadır. Standart DNA lif protokolü ile karşılaştırıldığında, S1 nükleaz içeren DNA lifi sadece iki ekstra adım gerektirir: çekirdeklere maruz kalma (hücre geçirgenliği) ve S1 nükleaz ile tedavi. Genotoksik ajanla tedavi edilen ancak S1 nükleazı olmayan örnekler ve genotoksik ajan olmadan S1 nükleazı ile muamele edilen örnekler gibi uygun kontrollerin zorunlu olduğunu belirtmek önemlidir. Analogların dahil edilmesi, S1 tedavisi ve yayılması da dahil olmak üzere protokolün kendisi bir günde gerçekleştirilebilir ve istisnai malzeme gerektirmez. Sadece timidin analogları, saflaştırılmış S1 nükleaz, uygun birincil ve ikincil antikorlar ve bir floresan mikroskop gerektirir. Genel olarak, S1 nükleazını kullanan DNA lifi, nispeten basit bir yaklaşım kullanarak devam eden replikasyon çatallarındaki ssDNA boşluklarını tespit eder.

Replikasyon stres tepki mekanizmalarının bir sonucu olarak oluşan post-replikatif ssDNA boşlukları, boşluk doldurma veya replikasyon sonrası onarım (PRR) adı verilen bir süreçte, translezyon DNA sentezi veya şablon değiştirme dahil olmak üzere farklı mekanizmalarla onarılabilir (veya doldurulabilir)²⁵. Bu süreçler, replikasyondan bağımsız DNA sentezi^{14,26,27’yi} içeren ilerleyen çatalların arkasında gerçekleşir. Bu bulgulara dayanarak, G2 fazındaki boşluk doldurma olaylarını doğrudan^14,16,26,28 görselleştirmek için standart DNA lif testinden farklı bir etiketleme şeması gerçekleştirilebilir. Spesifik olarak, bir timidin analoğu, genotoksik tedavi ve replikatif sonrası ssDNA boşluk oluşumu sırasında replikasyon çatalını etiketlemek için kullanılabilirken, başka bir timidin analoğu boşluk doldurma olaylarını etiketlemek için kullanılabilir. Bu protokolde, hücreler 1 saat boyunca genotoksik tedaviden hemen sonra veya eşzamanlı olarak ilk timidin analoğu (örneğin IdU) ile etiketlenir, böylece ortaya çıkan DNA boşluk oluşumu sırasında etiketlenir. Nokodazol, G2 / M’deki hücreleri tutuklamak için 12-24 saat arasında herhangi bir yerde tedaviye eklenir ve aşağıdaki S fazını önler. Nokodazol tedavisinin son 4 saati için, boşluk doldurma sırasında dahil edilecek ortama ikinci bir timidin analoğu (örneğin CldU) eklenir. Daha da önemlisi, bu tahlil sadece G2’deki boşluk doldurma olaylarını tespit etmek için kullanılabilir, çünkü CldU’dan gelen boşluk doldurma sinyali, CldU’nun S fazında DNA’yı çoğaltmaya dahil olması nedeniyle bir sinyalden ayırt edilemez. Bu nedenle, arka plan sinyalini en aza indirmek için, hasar indüksiyonundan sonra CldU birleşmesinin zamanlaması, hücre popülasyonunun çoğunun G2 faz^14’e girdiği zamana denk gelmelidir. Bu nedenle, bu zamanlama hücre hattına ve tedavi koşullarına bağlı olarak değişecektir. Bu tahlili kullanmadan önce hücre döngüsü ilerlemesini optimize etmeniz önerilir. Bu timidin analoglarının birlikte boyanması, ssDNA boşlukları oluşturulduğunda genotoksik tedavi sırasında sentezlenen yeni ortaya çıkan DNA’nın (IdU yolları) üstünde boşluk doldurma (PRR) yollarının (CldU yamaları) görselleştirilmesine izin verir.