Rilevamento di lacune post-replicative accumulo e riparazione nelle cellule umane utilizzando il test delle fibre di DNA

Lavori seminali hanno fornito prove dell’accumulo di lacune post-replicative a singolo filamento (ssDNA) durante il trattamento con agenti dannosi per il DNA nei batteri¹ e nelle cellule umane ^2,3. Durante la replicazione di modelli di DNA danneggiati, il meccanismo di sintesi del DNA può bypassare le lesioni impiegando specifiche DNA polimerasi di sintesi translesionale o attraverso meccanismi di commutazione del modello. In alternativa, il replisome può anche semplicemente saltare la lesione lasciando dietro di sé un gap di ssDNA, da riparare in seguito. Più recentemente, uno studio ha mostrato chiaramente che il trattamento con agenti genotossici porta a lacune di ssDNA negli eucarioti utilizzando la microscopia elettronica per visualizzare la struttura specifica degli intermedi di replicazione⁴. La formazione di queste regioni di lacune post-replicative è stata inizialmente proposta come un semplice risultato della modalità semi-discontinua di replicazione del DNA². In questo caso, una lesione sul filamento in ritardo può bloccare l’allungamento di un frammento di Okazaki, ma la progressione della forcella viene naturalmente salvata dal successivo frammento di Okazaki, lasciando dietro di sé un gap di ssDNA. Tuttavia, ulteriori studi hanno dimostrato che è anche possibile la formazione di lacune sul filamento principale, come dimostrato per la prima volta nei batteri⁵. Negli eucarioti, PRIMPOL, una DNA polimerasi unica con attività primasi, ha dimostrato di essere in grado di riavviare la sintesi del DNA a valle di una lesione che blocca la replicazione attraverso la sua attività di rimprovero 6,7,8,9,10,11. Pertanto, l’attività primasi di PRIMPOL può spiegare la formazione di lacune post-replicative di ssDNA nel filamento principale dopo il trattamento con un agente dannoso per il DNA nelle cellule umane¹². Tuttavia, il rilevamento di queste lacune e la riparazione delle lacune, fino a poco tempo fa, richiedevano approcci indiretti o dispendiosi in termini di tempo come la microscopia elettronica⁴ o i saggi basati su plasmidi¹³. L’uso della nucleasi S1 specifica per ssDNA per rilevare le lacune nelle cellule umane è stato sperimentato dai primi studi più di quarant’anni fa, utilizzando tecniche di gradiente di saccarosio ^2,3. Più recentemente, il nostro gruppo ha applicato l’uso di questa nucleasi per rilevare l’ssDNA nella replicazione del DNA (lacune post-replicative) utilizzando altri metodi come la fibra di DNA e i saggi delle comete¹⁴. Questi nuovi approcci hanno spianato la strada all’attuale ondata di studi sulle lacune post-replicative. Qui, descriviamo una strategia di utilizzo della nucleasi S1 per rilevare le lacune post-replicative di ssDNA mediante il test della fibra di DNA e spieghiamo come uno schema di etichettatura differenziale nel protocollo della fibra di DNA può consentire lo studio della riparazione di queste lacune.

Il test della fibra di DNA è una tecnica potente che è stata utilizzata da un numero crescente di laboratori e ha fornito preziose informazioni sulle dinamiche della forcella di replicazione e sui meccanismi di risposta allo stress di replicazione. In breve, questa tecnica si basa sull’incorporazione sequenziale di analoghi nucleotidici (come CldU -5-cloro-2′-deossiuridina-, e IdU -5-iodo-2′-deossiuridina) nel DNA replicante. Dopo la raccolta, le cellule vengono lisate e le molecole di DNA si diffondono su un vetrino rivestito positivamente. CldU e IdU vengono quindi rilevati da anticorpi specifici, che possono essere visualizzati in un microscopio fluorescente come fibre bicolori. Infine, le lunghezze dei tratti IdU e CldU vengono misurate per identificare eventuali alterazioni delle dinamiche di replicazione del DNA come conseguenza dell’induzione del danno al DNA. Questa tecnica può essere utilizzata per studiare diversi fenomeni, come lo stallo della forcella, il rallentamento della forcella, la degradazione del DNA nascente e le variazioni nella frequenza di sparo di origine^15,16.

Una limitazione del test della fibra di DNA è la sua risoluzione di poche kilobasi. Poiché le lacune post-replicative di ssDNA possono essere nell’intervallo di centinaia di basi, è impossibile visualizzare queste lacune direttamente dal protocollo standard della fibra di DNA. La presenza di lacune di ssDNA sulla replicazione del DNA in cellule umane trattate con agenti genotossici è stata indirettamente implicata in precedenza. Ad esempio, l’osservazione di ssDNA valutata mediante reclutamento della proteina legante ssDNA, della proteina di replicazione A (RPA), in cellule al di fuori della fase S, o la formazione di ssDNA rilevata dallo svolgimento del DNA alcalino combinata con l’assenza di stallo prolungato della forcella mediante test della fibra di DNA 12,17,18,19,20,21 è stato attribuito all’accumulo di lacune ssDNA. Inoltre, le lacune post-replicative di ssDNA inducono un checkpoint di fase G2/M dipendente dall’ATR e arrestano le cellule trattate con veleni replicanti 18,19,20,21,22.

La nucleasi S1 degrada gli acidi nucleici a singolo filamento rilasciando 5′-fosforile mono- o oligonucleotidi e ha un’affinità 5 volte superiore all’ssDNA rispetto all’RNA. Gli acidi nucleici a doppio filamento (DNA:DNA, DNA:RNA o RNA:RNA) sono resistenti alla nucleasi S1 tranne se usati in concentrazioni estremamente elevate. La nucleasi S1 fende anche il DNA a doppio filamento nella regione a singolo filamento causato da un nick, gap, mismatch o loop. La nucleasi S1 è quindi un’endonucleasi specifica per ssDNA in grado di scindere le lacune ssDNA, generando infine rotture a doppio filamento^23,24. Pertanto, l’aggiunta di passaggi per la digestione della nucleasi S1 al protocollo della fibra di DNA consente indirettamente il rilevamento di lacune post-replicative di ssDNA. In presenza di lacune, il trattamento dei nuclei esposti con la nucleasi S1 prima della diffusione del DNA genererà tratti più corti come conseguenza della scissione S1 di ssDNA intrinsecamente presente nelle lacune¹⁴. Di conseguenza, l’accorciamento del tratto è la lettura per le lacune ssDNA utilizzando questo approccio. Rispetto al protocollo standard della fibra di DNA, la fibra di DNA con la nucleasi S1 richiede solo due passaggi aggiuntivi: l’esposizione ai nuclei (permeabilizzazione cellulare) e il trattamento con la nucleasi S1. È importante notare che sono obbligatori controlli appropriati, come i campioni trattati con l’agente genotossico ma senza la nucleasi S1 e i campioni trattati con la nucleasi S1 senza l’agente genotossico. Il protocollo stesso, compresa l’incorporazione di analoghi, il trattamento S1 e la diffusione, può essere eseguito in un giorno e non richiede materiale eccezionale. Richiede solo gli analoghi della timidina, la nucleasi S1 purificata, gli anticorpi primari e secondari appropriati e un microscopio fluorescente. Nel complesso, la fibra di DNA che impiega la nucleasi S1 rileva le lacune di ssDNA sulle forche di replicazione in corso utilizzando un approccio relativamente semplice.

Le lacune post-replicative di ssDNA formate come conseguenza dei meccanismi di risposta allo stress di replicazione possono essere riparate (o riempite) da diversi meccanismi, tra cui la sintesi del DNA translesionale o la commutazione del modello, in un processo chiamato gap-filling o post-replication repair (PRR)²⁵. Questi processi avvengono dietro le forche che avanzano, coinvolgendo la sintesi del DNA indipendente dalla replicazione 14,26,27. Sulla base di questi risultati, è possibile eseguire uno schema di etichettatura distinto dal test standard della fibra di DNA per visualizzare gli eventi di riempimento delle lacune nella fase G2 direttamente ^14,16,26,28. In particolare, un analogo della timidina può essere utilizzato per etichettare la forcella di replicazione al momento del trattamento genotossico e della formazione post-replicativa del gap ssDNA, mentre un altro analogo della timidina può essere utilizzato per etichettare gli eventi di riempimento del gap. In questo protocollo, le cellule vengono etichettate con un primo analogo della timidina (IdU, ad esempio) immediatamente dopo o in concomitanza con un trattamento genotossico per 1 ora, in modo che il DNA nascente sia etichettato al momento della formazione del gap. Nocodazolo viene aggiunto durante il trattamento per un periodo compreso tra 12-24 ore per arrestare le cellule in G2 / M, prevenendo la successiva fase S. Per le ultime 4 ore di trattamento con nocodazolo, un secondo analogo della timidina (CldU, ad esempio) viene aggiunto al mezzo da incorporare durante il riempimento del gap. È importante sottolineare che questo test può essere utilizzato solo per rilevare eventi di riempimento del gap in G2 perché il segnale di riempimento del gap da CldU non può essere distinto da un segnale a causa dell’incorporazione di CldU nel DNA replicante nella fase S. Pertanto, per ridurre al minimo il segnale di fondo, i tempi di incorporazione di CldU dopo l’induzione del danno dovrebbero coincidere con quando la maggior parte della popolazione cellulare sta entrando nella fase G2¹⁴. Pertanto, questa tempistica varierà a seconda della linea cellulare e delle condizioni di trattamento. Si consiglia di ottimizzare la progressione del ciclo cellulare prima di utilizzare questo test. La co-colorazione di questi analoghi della timidina consente la visualizzazione di tratti di riempimento del gap (PRR) (cerotti CldU) sopra il DNA nascente (tratti IdU) sintetizzato durante il trattamento genotossico quando sono stati generati spazi vuoti di ssDNA.