Nachweis der postreplizierenden Lückenakkumulation und -reparatur in menschlichen Zellen mit dem DNA-Faser-Assay

Bahnbrechende Arbeiten haben Hinweise auf die Anhäufung von postreplizierenden einzelsträngigen (ssDNA) Lücken bei der Behandlung mit DNA-schädigenden Wirkstoffen in Bakterien 1 und menschlichen Zellen ^2,3 geliefert. Während der Replikation beschädigter DNA-Vorlagen kann die DNA-Synthese-Maschinerie die Läsionen umgehen, indem sie spezifische Transläsionssynthese-DNA-Polymerasen oder durch Template-Switching-Mechanismen verwendet. Alternativ kann das Replisom auch einfach die Läsion überspringen und eine ssDNA-Lücke hinterlassen, die später repariert werden soll. In jüngerer Zeit zeigte eine Studie deutlich, dass die Behandlung mit genotoxischen Wirkstoffen zu ssDNA-Lücken in Eukaryoten führt, indem Elektronenmikroskopie verwendet wird, um die spezifische Struktur von Replikationszwischenprodukten zu visualisieren⁴. Die Bildung dieser Regionen postreplikativer Lücken wurde ursprünglich als einfaches Ergebnis des semi-diskontinuierlichen Modus der DNA-Replikation^{vorgeschlagen 2}. In diesem Fall kann eine Läsion am nachlaufenden Strang die Verlängerung eines Okazaki-Fragments blockieren, aber die Gabelprogression wird natürlich durch das folgende Okazaki-Fragment gerettet und hinterlässt eine ssDNA-Lücke. Weitere Studien zeigten jedoch, dass auch die Bildung von Lücken am führenden Strang möglich ist, wie erstmals bei Bakterien^{gezeigt wurde 5}. In Eukaryoten wurde gezeigt, dass PRIMPOL, eine einzigartige DNA-Polymerase mit Primase-Aktivität, in der Lage ist, die DNA-Synthese stromabwärts einer replikationsblockierenden Läsion durch ihre Zurechtweisungsaktivität 6,7,8,9,10,11 wieder aufzunehmen. Somit kann die PRIMPOL-Primase-Aktivität die Bildung von postreplizierenden ssDNA-Lücken im führenden Strang bei der Behandlung mit einem DNA-schädigenden Wirkstoff in menschlichen Zellen^{erklären 12}. Dennoch erforderte der Nachweis dieser Lücken sowie die Lückenreparatur bis vor kurzem indirekte oder zeitaufwändige Ansätze wie Elektronenmikroskopie⁴ oder plasmidbasierte Assays¹³. Die Verwendung der ssDNA-spezifischen S1-Nuklease zum Nachweis von Lücken in menschlichen Zellen wurde vor mehr als vierzig Jahren durch frühe Studien unter Verwendung von Saccharosegradiententechniken^{vorangetrieben 2,3}. In jüngerer Zeit wandte unsere Gruppe die Verwendung dieser Nuklease an, um ssDNA bei der Replikation von DNA (postreplizierte Lücken) mit anderen Methoden wie DNA-Faser- und Kometenassays¹⁴ nachzuweisen. Diese neuen Ansätze ebneten den Weg für die aktuelle Welle von Studien zu postreplizierenden Lücken. Hier beschreiben wir eine Strategie der Verwendung von S1-Nuklease zum Nachweis postreplizierter ssDNA-Lücken durch DNA-Faserassay und erklären, wie ein differentielles Markierungsschema im DNA-Faserprotokoll die Untersuchung der Reparatur dieser Lücken ermöglichen kann.

Der DNA-Faser-Assay ist eine leistungsstarke Technik, die von einer wachsenden Anzahl von Labors eingesetzt wurde und wertvolle Einblicke in die Replikationsgabeldynamik und die Replikationsstressreaktionsmechanismen geliefert hat. Kurz gesagt, diese Technik basiert auf dem sequentiellen Einbau von Nukleotidanaloga (wie CldU-5-Chlor-2′-desoxyuridin- und IdU-5-Jod-2′-desoxyuridin) in die replizierende DNA. Nach der Ernte werden Zellen lysiert und DNA-Moleküle auf einem positiv beschichteten Glasobjektträger verteilt. CldU und IdU werden dann durch spezifische Antikörper nachgewiesen, die in einem fluoreszierenden Mikroskop als zweifarbige Fasern sichtbar gemacht werden können. Schließlich werden die Längen der IdU- und CldU-Trakte gemessen, um Veränderungen der DNA-Replikationsdynamik als Folge der DNA-Schadensinduktion zu identifizieren. Diese Technik kann verwendet werden, um verschiedene Phänomene zu untersuchen, wie z.B. Gabelabriss, Gabelverlangsamung, entstehender DNA-Abbau und Variationen in der Häufigkeit des Ursprungsfeuers^15,16.

Eine Einschränkung des DNA-Faser-Assays ist seine Auflösung von wenigen Kilobasen. Da postreplizierte ssDNA-Lücken im Bereich von Hunderten von Basen liegen können, ist es unmöglich, diese Lücken direkt mit dem Standard-DNA-Faserprotokoll zu visualisieren. Das Vorhandensein von ssDNA-Lücken auf replizierender DNA in menschlichen Zellen, die mit genotoxischen Wirkstoffen behandelt wurden, wurde bereits indirekt in Verbindung gebracht. Zum Beispiel die Beobachtung von ssDNA, wie sie durch Rekrutierung des ssDNA-bindenden Proteins, des Replikationsproteins A (RPA), in Zellen außerhalb der S-Phase bewertet wird, oder die Bildung von ssDNA, wie sie durch alkalische DNA-Abwicklung nachgewiesen wird, kombiniert mit dem Fehlen eines längeren Gabelstopps durch DNA-Faserassay 12,17,18,19,20,21 wurde auf die Anhäufung von ssDNA-Lücken zurückgeführt. Darüber hinaus induzieren postreplizierte ssDNA-Lücken einen ATR-abhängigen G2/M-Phasen-Checkpoint und blockieren Zellen, die mit Replikationsgiften 18,19,20,21,22 behandelt wurden.

Die S1-Nuklease baut einzelsträngige Nukleinsäuren unter Freisetzung von 5′-Phosphorylmono- oder Oligonukleotiden ab und hat im Vergleich zu RNA eine 5-mal höhere Affinität zu ssDNA. Doppelsträngige Nukleinsäuren (DNA:DNA, DNA:RNA oder RNA:RNA) sind resistent gegen die S1-Nuklease, außer wenn sie in extrem hohen Konzentrationen eingesetzt werden. Die S1-Nuklease spaltet auch doppelsträngige DNA in der einzelsträngigen Region, die durch einen Nick, eine Lücke, eine Fehlanpassung oder eine Schleife verursacht wird. Die S1-Nuklease ist somit eine ssDNA-spezifische Endonuklease, die in der Lage ist, ssDNA-Lücken zu spalten und letztendlich doppelsträngige Brüche^23,24 zu erzeugen. Das Hinzufügen von Schritten für den S1-Nuklease-Aufschluss zum DNA-Faserprotokoll ermöglicht daher indirekt den Nachweis von postreplizierenden ssDNA-Lücken. In Gegenwart von Lücken erzeugt die Behandlung von exponierten Kernen mit der S1-Nuklease vor der DNA-Ausbreitung kürzere Bahnen als Folge der S1-Spaltung der ssDNA, die von Natur aus in Lücken¹⁴ vorhanden ist. Dementsprechend ist die Traktverkürzung das Auslesen von ssDNA-Lücken mit diesem Ansatz. Im Vergleich zum Standard-DNA-Faserprotokoll benötigt die DNA-Faser mit der S1-Nuklease nur zwei zusätzliche Schritte: Kernexposition (Zellpermeabilisierung) und Behandlung mit der S1-Nuklease. Es ist wichtig zu beachten, dass geeignete Kontrollen obligatorisch sind, z. B. Proben, die mit dem genotoxischen Mittel, aber ohne die S1-Nuklease behandelt wurden, und Proben, die mit der S1-Nuklease ohne das genotoxische Mittel behandelt wurden. Das Protokoll selbst, einschließlich der Einbeziehung von Analoga, der S1-Behandlung und der Ausbreitung, kann an einem Tag durchgeführt werden und erfordert kein außergewöhnliches Material. Es benötigt nur die Thymidin-Analoga, die gereinigte S1-Nuklease, die entsprechenden primären und sekundären Antikörper und ein fluoreszierendes Mikroskop. Insgesamt erkennt die DNA-Faser, die die S1-Nuklease verwendet, ssDNA-Lücken auf laufenden Replikationsgabeln mit einem relativ einfachen Ansatz.

Die postreplizierten ssDNA-Lücken, die als Folge von Replikations-Stress-Response-Mechanismen gebildet werden, können durch verschiedene Mechanismen, einschließlich Transläsions-DNA-Synthese oder Template-Switching, in einem Prozess namens Gap-Filling oder Post-Replication Repair (PRR)²⁵ repariert (oder gefüllt) werden. Diese Prozesse finden hinter den vorrückenden Gabeln statt und beinhalten eine replikationsunabhängige DNA-Synthese ^14,26,27. Basierend auf diesen Ergebnissen kann ein Markierungsschema durchgeführt werden, das sich vom Standard-DNA-Faserassay unterscheidet, um lückenfüllende Ereignisse in der G2-Phase direkt zu visualisieren 14,16,26,28. Insbesondere kann ein Thymidinanalogon verwendet werden, um die Replikationsgabel zum Zeitpunkt der genotoxischen Behandlung und der postreplizierenden ssDNA-Lückenbildung zu markieren, während ein anderes Thymidinanalogon verwendet werden kann, um lückenfüllende Ereignisse zu markieren. In diesem Protokoll werden die Zellen unmittelbar nach oder gleichzeitig mit einer genotoxischen Behandlung für 1 h mit einem ersten Thymidinanalogon (z. B. IdU) markiert, so dass die entstehende DNA zum Zeitpunkt der Lückenbildung markiert wird. Nocodazol wird bei der Behandlung zwischen 12 und 24 h hinzugefügt, um Zellen in G2 / M zu stoppen und die folgende S-Phase zu verhindern. Für die letzten 4 h der Nocodazol-Behandlung wird dem Medium, das beim Lückenfüllen eingearbeitet werden soll, ein zweites Thymidinanalogon (z. B. CldU) zugesetzt. Wichtig ist, dass dieser Assay nur verwendet werden kann, um lückenfüllende Ereignisse in G2 zu erkennen, da das lückenfüllende Signal von CldU aufgrund der Einarbeitung von CldU in die replizierende DNA in der S-Phase nicht von einem Signal unterschieden werden kann. Um das Hintergrundsignal zu minimieren, sollte daher der Zeitpunkt der CldU-Inkorporation nach Schadensinduktion mit dem Zeitpunkt zusammenfallen, zu dem der größte Teil der Zellpopulation in die G2-Phase¹⁴ eintritt. Daher variiert dieser Zeitpunkt je nach Zelllinie und Behandlungsbedingungen. Es wird empfohlen, die Progression des Zellzyklus vor der Anwendung dieses Assays zu optimieren. Die Co-Färbung dieser Thymidin-Analoga ermöglicht die Visualisierung von lückenfüllenden (PRR) Trakten (CldU-Pflastern) auf aufkeimender DNA (IdU-Trakte), die während der genotoxischen Behandlung synthetisiert wurden, wenn ssDNA-Lücken erzeugt wurden.