Detección de acumulación y reparación de brechas post-replicativas en células humanas utilizando el ensayo de fibra de ADN

Los trabajos seminales han proporcionado evidencia de la acumulación de brechas post-replicativas de cadena simple (ssDNA) tras el tratamiento con agentes dañinos para el ADN en bacterias¹ y células humanas ^2,3. Durante la replicación de plantillas de ADN dañadas, la maquinaria de síntesis de ADN puede eludir las lesiones mediante el empleo de ADN polimerasas de síntesis de translesión específicas o a través de mecanismos de cambio de plantilla. Alternativamente, el replisoma también puede simplemente omitir la lesión dejando un espacio de ssDNA detrás, para ser reparado más tarde. Más recientemente, un estudio mostró claramente que el tratamiento con agentes genotóxicos conduce a brechas de ssDNA en eucariotas mediante el uso de microscopía electrónica para visualizar la estructura específica de los intermedios de replicación⁴. La formación de estas regiones de brechas post-replicativas se propuso inicialmente como un resultado simple del modo semi-discontinuo de replicación del ADN². En este caso, una lesión en la hebra rezagada puede bloquear el alargamiento de un fragmento de Okazaki, pero la progresión de la bifurcación es naturalmente rescatada por el siguiente fragmento de Okazaki, dejando atrás una brecha de ssDNA. Sin embargo, otros estudios demostraron que la formación de brechas en la hebra principal también es posible, como se mostró por primera vez en la bacteria⁵. En eucariotas, se demostró que PRIMPOL, una ADN polimerasa única con actividad de primasa, es capaz de reiniciar la síntesis de ADN aguas abajo de una lesión que bloquea la replicación a través de su actividad de reprimificación ^{6,7,8,9,10,11}. Por lo tanto, la actividad de la primasa PRIMPOL puede explicar la formación de brechas de ssDNA post-replicativas en la cadena principal tras el tratamiento con un agente dañino para el ADN en células humanas¹². No obstante, la detección de estas brechas, así como la reparación de brechas, hasta hace poco, requerían enfoques indirectos o lentos, como la microscopía electrónica⁴ o los ensayos basados en plásmidos¹³. El uso de la nucleasa S1 específica de ssDNA para detectar brechas en las células humanas fue pionero en estudios tempranos hace más de cuarenta años, utilizando técnicas de gradiente de sacarosa ^2,3. Más recientemente, nuestro grupo aplicó el uso de esta nucleasa para detectar ssDNA en la replicación de ADN (brechas post-replicativas) utilizando otros métodos como la fibra de ADN y los ensayos de cometas¹⁴. Estos nuevos enfoques allanaron el camino para el actual aumento de estudios sobre las brechas post-replicativas. Aquí, describimos una estrategia de uso de nucleasa S1 para detectar brechas de ssDNA post-replicativas mediante ensayo de fibra de ADN y explicamos cómo un esquema de etiquetado diferencial en el protocolo de fibra de ADN puede permitir el estudio de la reparación de estas brechas.

El ensayo de fibra de ADN es una técnica poderosa que ha sido utilizada por un número creciente de laboratorios y ha proporcionado información valiosa sobre la dinámica de la bifurcación de replicación y los mecanismos de respuesta al estrés de replicación. Brevemente, esta técnica se basa en la incorporación secuencial de análogos de nucleótidos (como CldU -5-cloro-2′-desoxiuridina-, e IdU -5-yodo-2′-desoxiuridina) en el ADN replicante. Después de la cosecha, las células se lisan y las moléculas de ADN se propagan en un portaobjetos de vidrio recubierto positivamente. CldU e IdU son detectados por anticuerpos específicos, que se pueden visualizar en un microscopio fluorescente como fibras bicolores. Finalmente, las longitudes de los tractos IdU y CldU se miden para identificar cualquier alteración de la dinámica de replicación del ADN como consecuencia de la inducción del daño del ADN. Esta técnica se puede utilizar para investigar diferentes fenómenos, como el estancamiento de la horquilla, la desaceleración de la bifurcación, la degradación del ADN naciente y las variaciones en la frecuencia de disparo de origen^15,16.

Una limitación del ensayo de fibra de ADN es su resolución de unas pocas kilobases. Debido a que las brechas de ssDNA post-replicativas pueden estar en el rango de cientos de bases, es imposible visualizar estas brechas directamente mediante el protocolo estándar de fibra de ADN. La presencia de brechas de ssDNA en la replicación del ADN en células humanas tratadas con agentes genotóxicos se ha implicado indirectamente antes. Por ejemplo, la observación del ssDNA evaluado por el reclutamiento de la proteína de unión al ssDNA, la proteína de replicación A (RPA), en células fuera de la fase S, o la formación de ssDNA detectada por el desenrollamiento alcalino del ADN combinado con la ausencia de estancamiento prolongado de la horquilla por el ensayo de fibra de ADN 12,17,18,19,20,21 se atribuyó a la acumulación de brechas de ssDNA. Además, las brechas de ssDNA post-replicativas inducen un punto de control de fase G2/M dependiente de ATR y células de detención tratadas con venenos de replicación 18,19,20,21,22.

La nucleasa S1 degrada los ácidos nucleicos monocatenarios liberando mono u oligonucleótidos de 5′-fosforilo y tiene una afinidad 5 veces mayor con el ssDNA en comparación con el ARN. Los ácidos nucleicos de doble cadena (ADN: ADN, ADN: ARN o ARN: ARN) son resistentes a la nucleasa S1, excepto cuando se usan en concentraciones extremadamente altas. La nucleasa S1 también escinde ADN de doble cadena en la región de cadena simple causada por un corte, brecha, desajuste o bucle. La nucleasa S1 es, por lo tanto, una endonucleasa específica de ssDNA capaz de cortar los huecos de ssDNA, generando finalmente roturas de doble cadena^23,24. Por lo tanto, agregar pasos para la digestión de la nucleasa S1 al protocolo de fibra de ADN indirectamente permite la detección de brechas de ssDNA post-replicativas. En presencia de huecos, el tratamiento de los núcleos expuestos con la nucleasa S1 antes de la propagación del ADN generará tractos más cortos como consecuencia de la escisión S1 del ssDNA inherentemente presente en los huecos¹⁴. En consecuencia, el acortamiento del tracto es la lectura de las brechas de ssDNA utilizando este enfoque. En comparación con el protocolo estándar de fibra de ADN, la fibra de ADN con la nucleasa S1 solo requiere dos pasos adicionales: exposición a los núcleos (permeabilización celular) y tratamiento con la nucleasa S1. Es importante tener en cuenta que los controles apropiados son obligatorios, como muestras tratadas con el agente genotóxico pero sin la nucleasa S1 y muestras tratadas con la nucleasa S1 sin el agente genotóxico. El protocolo en sí, incluida la incorporación de análogos, el tratamiento S1 y la propagación, se puede realizar en un día y no requiere material excepcional. Solo requiere los análogos de timidina, la nucleasa S1 purificada, los anticuerpos primarios y secundarios apropiados y un microscopio fluorescente. En general, la fibra de ADN que emplea la nucleasa S1 detecta las brechas de ssDNA en las bifurcaciones de replicación en curso utilizando un enfoque relativamente simple.

Las brechas post-replicativas de ssDNA formadas como consecuencia de los mecanismos de respuesta al estrés de replicación pueden ser reparadas (o llenadas) por diferentes mecanismos, incluida la síntesis de ADN translesivo o el cambio de plantilla, en un proceso llamado llenado de brechas o reparación posterior a la replicación (PRR)²⁵. Estos procesos ocurren detrás de las bifurcaciones que avanzan, involucrando la síntesis de ADN independiente de la replicación 14,26,27. Sobre la base de estos hallazgos, se puede realizar un esquema de etiquetado distinto del ensayo estándar de fibra de ADN para visualizar eventos de llenado de brechas en la fase G2 directamente 14,16,26,28. Específicamente, un análogo de timidina se puede usar para etiquetar la bifurcación de replicación en el momento del tratamiento genotóxico y la formación de brechas de ssDNA post-replicativa, mientras que otro análogo de timidina se puede usar para etiquetar eventos de llenado de brechas. En este protocolo, las células se etiquetan con un primer análogo de timidina (IdU, por ejemplo) inmediatamente después o concomitantemente con el tratamiento genotóxico durante 1 h, de modo que el ADN naciente se marca en el momento de la formación de la brecha. El nocodazol se agrega tras el tratamiento durante entre 12-24 h para detener las células en G2 / M, previniendo la siguiente fase S. Durante las últimas 4 h de tratamiento con nocodazol, se agrega un segundo análogo de timidina (CldU, por ejemplo) al medio para incorporarlo durante el llenado de huecos. Es importante destacar que este ensayo solo se puede usar para detectar eventos de llenado de brechas en G2 porque la señal de llenado de brechas de CldU no se puede distinguir de una señal debido a la incorporación de CldU en la replicación de ADN en la fase S. Por lo tanto, para minimizar la señal de fondo, el momento de la incorporación de CldU después de la inducción del daño debe coincidir con el momento en que la mayoría de la población celular está entrando en la fase^{G2 14}. Por lo tanto, este momento variará dependiendo de la línea celular y las condiciones de tratamiento. Se recomienda optimizar la progresión del ciclo celular antes de emplear este ensayo. La tinción conjunta de estos análogos de timidina permite la visualización de tractos de relleno de huecos (PRR) (parches CldU) sobre ADN naciente (tractos IdU) sintetizados durante el tratamiento genotóxico cuando se generaron huecos de ssDNA.