Détection de l’accumulation et de la réparation des lacunes post-réplicatives dans les cellules humaines à l’aide du test de fibre d’ADN

Des travaux séminaux ont fourni des preuves de l’accumulation de lacunes monocaténaires post-réplicatives (ADNSS) lors d’un traitement avec des agents endommageant l’ADN dans les bactéries¹ et les cellules humaines ^2,3. Lors de la réplication de modèles d’ADN endommagés, la machinerie de synthèse de l’ADN peut contourner les lésions en utilisant des ADN polymérases de synthèse de translésion spécifiques ou par des mécanismes de commutation de gabarit. Alternativement, le réplisome peut également simplement sauter la lésion laissant un espace ssDNA derrière, pour être réparé plus tard. Plus récemment, une étude a clairement montré que le traitement avec des agents génotoxiques conduit à des lacunes en aDNS SS chez les eucaryotes en utilisant la microscopie électronique pour visualiser la structure spécifique des intermédiaires de réplication⁴. La formation de ces régions de lacunes post-réplicatives a été initialement proposée comme étant un résultat simple du mode semi-discontinu de réplication de l’ADN². Dans ce cas, une lésion sur le brin en retard peut bloquer l’allongement d’un fragment d’Okazaki, mais la progression de la fourche est naturellement sauvée par le fragment d’Okazaki suivant, laissant derrière elle un espace d’ADNSS. Cependant, d’autres études ont démontré que la formation de lacunes sur le brin principal est également possible, comme l’a d’abord montré la bactérie⁵. Chez les eucaryotes, PRIMPOL, une ADN polymérase unique avec une activité primase, s’est avérée capable de redémarrer la synthèse de l’ADN en aval d’une lésion bloquant la réplication grâce à son activité d’amorçage 6,7,8,9,10,11. Ainsi, l’activité primase de PRIMPOL peut expliquer la formation de lacunes post-réplicatives d’ADNSS dans le brin principal lors du traitement avec un agent endommageant l’ADN dans les cellules humaines¹². Néanmoins, la détection de ces lacunes ainsi que la réparation des lacunes, jusqu’à récemment, nécessitaient des approches indirectes ou chronophages telles que la microscopie électronique⁴ ou les essais à base de plasmides¹³. L’utilisation de la nucléase S1 spécifique à l’ADNSS pour détecter les lacunes dans les cellules humaines a été mise au point par des études préliminaires il y a plus de quarante ans, en utilisant des techniques de gradient de saccharose ^2,3. Plus récemment, notre groupe a appliqué l’utilisation de cette nucléase pour détecter l’ADNSs dans la réplication de l’ADN (lacunes post-réplicatives) en utilisant d’autres méthodes telles que les tests de fibres d’ADN et de comètes¹⁴. Ces nouvelles approches ont ouvert la voie à la vague actuelle d’études sur les lacunes post-réplicatives. Ici, nous décrivons une stratégie d’utilisation de la nucléase S1 pour détecter les écarts post-réplicatifs de l’ADNSs par un test de fibre d’ADN et expliquons comment un schéma de marquage différentiel dans le protocole de fibre d’ADN peut permettre l’étude de la réparation de ces lacunes.

Le test de la fibre d’ADN est une technique puissante qui a été utilisée par un nombre croissant de laboratoires et a fourni des informations précieuses sur la dynamique de la fourche de réplication et les mécanismes de réponse au stress de réplication. En bref, cette technique est basée sur l’incorporation séquentielle d’analogues nucléotidiques (tels que CldU-5-chloro-2′-désoxyuridine-, et IdU-5-iodo-2′-désoxyuridine) dans l’ADN répliquant. Après la récolte, les cellules sont lysées et les molécules d’ADN se propagent sur une lame de verre recouverte positivement. CldU et IdU sont ensuite détectés par des anticorps spécifiques, qui peuvent être visualisés dans un microscope fluorescent sous forme de fibres bicolores. Enfin, les longueurs des voies IdU et CldU sont mesurées pour identifier toute altération de la dynamique de réplication de l’ADN résultant de l’induction de dommages à l’ADN. Cette technique peut être utilisée pour étudier différents phénomènes, tels que le décrochage de la fourche, le ralentissement de la fourche, la dégradation naissante de l’ADN et les variations de la fréquence de tir d’origine^15,16.

Une limitation du test de fibre d’ADN est sa résolution de quelques kilobases. Parce que les écarts d’ADNSs post-réplicatifs peuvent être de l’ordre de centaines de bases, il est impossible de visualiser ces écarts directement par le protocole standard de fibre d’ADN. La présence de lacunes en ADNS SSD sur la réplication de l’ADN dans les cellules humaines traitées avec des agents génotoxiques a déjà été indirectement impliquée. Par exemple, l’observation de l’ADNSs tel qu’évalué par le recrutement de la protéine de liaison à l’ADNSS, la protéine de réplication A (RPA), dans les cellules en dehors de la phase S, ou la formation d’ADNSs détectés par le déroulement de l’ADN alcalin combiné à l’absence de décrochage prolongé de la fourche par le test de fibre d’ADN ^{12,17,18,19,20,21} a été attribuée à l’accumulation de lacunes en ADNSs. En outre, les écarts post-réplicatifs de l’ADNSS induisent un point de contrôle de phase G2/M dépendant de l’ATR et des cellules d’arrêt traitées avec des poisons de réplication ^{18,19,20,21,22}.

La nucléase S1 dégrade les acides nucléiques monocaténaires libérant des mono- ou oligonucléotides 5′-phosphoryle et a une affinité 5 fois plus élevée pour l’ADNSS par rapport à l’ARN. Les acides nucléiques double brin (ADN:ADN, ADN:ARN ou ARN:ARN) sont résistants à la nucléase S1, sauf lorsqu’ils sont utilisés à des concentrations extrêmement élevées. La nucléase S1 clive également l’ADN double brin dans la région simple brin causée par une entaille, un espace, un décalage ou une boucle. La nucléase S1 est donc une endonucléase spécifique de l’ADNSS capable de cliver les espaces d’ADNSS, générant finalement des cassures double brin^23,24. Ainsi, l’ajout d’étapes pour la digestion de la nucléase S1 au protocole de fibre d’ADN permet indirectement la détection des lacunes post-réplicatives de l’ADNSS. En présence de lacunes, le traitement des noyaux exposés avec la nucléase S1 avant la propagation de l’ADN générera des étendues plus courtes en raison du clivage S1 de l’ADNSSS intrinsèquement présent aux lacunes¹⁴. En conséquence, le raccourcissement du tractus est la lecture des écarts d’ADNSs à l’aide de cette approche. Par rapport au protocole standard de fibre d’ADN, la fibre d’ADN avec la nucléase S1 ne nécessite que deux étapes supplémentaires: l’exposition aux noyaux (perméabilisation cellulaire) et le traitement avec la nucléase S1. Il est important de noter que des contrôles appropriés sont obligatoires, tels que des échantillons traités avec l’agent génotoxique mais sans la nucléase S1 et des échantillons traités avec la nucléase S1 sans l’agent génotoxique. Le protocole lui-même, y compris l’incorporation d’analogues, le traitement S1 et l’épandage, peut être effectué en une journée et ne nécessite pas de matériel exceptionnel. Il ne nécessite que les analogues de la thymidine, la nucléase S1 purifiée, les anticorps primaires et secondaires appropriés et un microscope fluorescent. Dans l’ensemble, la fibre d’ADN utilisant la nucléase S1 détecte les lacunes de l’ADNS sur les fourches de réplication en cours en utilisant une approche relativement simple.

Les lacunes post-réplicatives de l’ADSSS formées à la suite des mécanismes de réponse au stress de réplication peuvent être réparées (ou comblées) par différents mécanismes, y compris la synthèse de l’ADN de translésion ou le changement de modèle, dans un processus appelé remplissage des lacunes ou réparation post-réplication (PRR)²⁵. Ces processus se produisent derrière les fourches avancées, impliquant une synthèse d’ADN indépendante de la réplication 14,26,27. Sur la base de ces résultats, un schéma d’étiquetage distinct du test standard de fibres d’ADN peut être effectué pour visualiser les événements de comblement des lacunes dans la phase G2 directement 14,16,26,28. Plus précisément, un analogue de la thymidine peut être utilisé pour marquer la fourche de réplication au moment du traitement génotoxique et de la formation post-réplicative de l’écart d’ADNSs, tandis qu’un autre analogue de la thymidine peut être utilisé pour marquer les événements de comblement de l’écart. Dans ce protocole, les cellules sont marquées avec un premier analogue de la thymidine (IdU, par exemple) immédiatement après ou en concomitance avec un traitement génotoxique pendant 1 h, de sorte que l’ADN naissant est marqué au moment de la formation de l’écart. Le nocodazole est ajouté pendant le traitement pendant 12 à 24 heures pour arrêter les cellules dans G2 / M, empêchant la phase S suivante. Pendant les 4 dernières heures de traitement au nocodazole, un deuxième analogue de thymidine (CldU, par exemple) est ajouté au milieu à incorporer lors du remplissage de l’espace. Il est important de noter que ce test ne peut être utilisé que pour détecter les événements de remplissage d’écart dans G2, car le signal de remplissage d’écart de CldU ne peut pas être distingué d’un signal en raison de l’incorporation de CldU dans l’ADN répliquant dans la phase S. Par conséquent, pour minimiser le signal de fond, le moment de l’incorporation de CldU après l’induction des dommages devrait coïncider avec le moment où la majeure partie de la population cellulaire entre dans la phase^{G2 14}. Par conséquent, ce moment variera en fonction de la lignée cellulaire et des conditions de traitement. Il est conseillé d’optimiser la progression du cycle cellulaire avant d’utiliser ce test. La co-coloration de ces analogues de la thymidine permet la visualisation des voies de remplissage des lacunes (PRR) (patchs CldU) au-dessus de l’ADN naissant (tractus IdU) synthétisé pendant le traitement génotoxique lorsque des lacunes en aDNs ont été générées.