Detecção de acumulação e reparo de lacunas pós-replicativas em células humanas usando o ensaio de fibra de DNA

Trabalhos seminais têm proporcionado evidências do acúmulo de lacunas pós-replicativas de single-stranded (ssDNA) após o tratamento com agentes prejudiciais ao DNA em bactérias¹ e células humanas ^2,3. Durante a replicação de modelos de DNA danificados, o maquinário de síntese de DNA pode contornar as lesões empregando polimerases específicas de DNA de translesão ou através de mecanismos de comutação de modelos. Alternativamente, o replisome também pode simplesmente pular a lesão deixando uma lacuna ssDNA para trás, para ser reparado mais tarde. Mais recentemente, um estudo mostrou claramente que o tratamento com agentes genotóxicos leva a lacunas de SSDNA em eucariotes utilizando microscopia eletrônica para visualizar a estrutura específica dos intermediários de replicação⁴. A formação dessas regiões de lacunas pós-replicativas foi inicialmente proposta como um simples resultado do modo semicontínuo de replicação de DNA². Neste caso, uma lesão na cadeia defasada pode bloquear o alongamento de um fragmento de Okazaki, mas a progressão do garfo é naturalmente resgatada pelo seguinte fragmento de Okazaki, deixando para trás uma lacuna de SSDNA. No entanto, outros estudos demonstraram que a formação de lacunas na cadeia líder também é possível, como mostrado pela primeira vez na bactéria⁵. Nos eucariotes, primpol, uma polimerase de DNA única com atividade primase, mostrou-se capaz de reiniciar a síntese de DNA a jusante uma lesão de bloqueio de replicação através de sua atividade^de replicação 6,7,8,9,10,11. Assim, a atividade primase primpol pode explicar a formação de lacunas de SSDNA pós-replicativa na cadeia líder após o tratamento com um agente prejudicial ao DNA em células humanas¹². No entanto, a detecção dessas lacunas, bem como o reparo de lacunas, até recentemente, exigiu abordagens indiretas ou demoradas, como microscopia eletrônica⁴ ou ensaios baseados em plasmídeos¹³. O uso da nuclease S1 específica do SSDNA para detectar lacunas em células humanas foi pioneiro por estudos iniciais há mais de quarenta anos, utilizando técnicas de gradiente^de sacarose ^2,3. Mais recentemente, nosso grupo aplicou o uso deste nuclease para detectar ssDNA na replicação de DNA (lacunas pós-replicativas) usando outros métodos como fibra de DNA e ensaios de cometa¹⁴. Essas novas abordagens abriram caminho para a atual onda de estudos sobre lacunas pós-replicativas. Aqui, descrevemos uma estratégia de uso da nuclease S1 para detectar lacunas de SSNA pós-replicativas por ensaio de fibra de DNA e explicar como um esquema diferenciado de rotulagem no protocolo de fibra de DNA pode permitir o estudo do reparo dessas lacunas.

O ensaio de fibra de DNA é uma técnica poderosa que tem sido usada por um número crescente de laboratórios e forneceu insights valiosos sobre a dinâmica do garfo de replicação e mecanismos de resposta ao estresse de replicação. Resumidamente, esta técnica é baseada na incorporação sequencial de análogos nucleotídeos (como CLdU -5-chloro-2′-desoxyuridine-, e IdU -5-iodo-2′-deoxyuridina) no DNA replicante. Após a colheita, as células são lístidas, e moléculas de DNA se espalham em um slide de vidro revestido positivamente. A UI e a IdU são então detectadas por anticorpos específicos, que podem ser visualizados em um microscópio fluorescente como fibras bicolorizadas. Finalmente, os comprimentos dos tratos de IdU e CLdU são medidos para identificar quaisquer alterações da dinâmica de replicação de DNA como consequência da indução de danos de DNA. Essa técnica pode ser utilizada para investigar diferentes fenômenos, como empatou o garfo, desaceleração do garfo, degradação nascente do DNA e variações na frequência de origem disparando^15,16.

Uma limitação do ensaio de fibra de DNA é a resolução de algumas quilobases. Como as lacunas de SSNA pós-replicação podem estar na faixa de centenas de bases, é impossível visualizar essas lacunas diretamente pelo protocolo padrão de fibra de DNA. A presença de lacunas de SSDNA na replicação do DNA em células humanas tratadas com agentes genotoxicos já foi indiretamente implicada antes. Por exemplo, a observação do SSDNA como avaliado pelo recrutamento da proteína de ligação ssDNA, proteína de replicação A (RPA), em células fora da fase S, ou a formação de ssDNA como detectado pelo desenrolar do DNA alcalino combinado com a ausência de bifurcação prolongada por fibra de DNA, conforme 12,17,18,19,20,21 foi atribuído ao acúmulo de lacunas de SSDNA. Além disso, as lacunas de SDNA pós-replicação induzem um ponto de verificação de fase G2/M dependente de ATR e células de prisão tratadas com venenos de replicação 18,19,20,21,22.

O nuclease S1 degrada ácidos nucleicos de fio único liberando mono-ligonucleotídeos de 5′-phosforryl ou oligonucleotídeos e tem uma afinidade 5 vezes maior com o SSDNA em comparação com o RNA. Ácidos nucleicos de dupla tração (DNA:DNA, DNA:RNA ou RNA:RNA) são resistentes à nuclease S1, exceto quando usados em concentrações extremamente altas. A nuclease S1 também corta DNA de dupla renda na região de um único fio causada por um corte, lacuna, incompatibilidade ou loop. A nuclease S1 é, portanto, uma endonuclease específica do SSDNA capaz de cortar lacunas de SSDNA, gerando, em última análise, quebras duplas^{encalhadas 23,24}. Assim, adicionar etapas para a digestão de nuclease S1 ao protocolo de fibra de DNA indiretamente permite a detecção de lacunas ssDNA pós-replicativas. Na presença de lacunas, o tratamento de núcleos expostos com a nuclease S1 antes da disseminação do DNA gerará tratos mais curtos como consequência do decote S1 do SSDNA inerentemente presente nas lacunas¹⁴. Assim, o encurtamento do trato é a leitura para lacunas ssDNA usando esta abordagem. Em comparação com o protocolo padrão de fibra de DNA, a fibra de DNA com a nuclease S1 requer apenas dois passos extras: exposição de núcleos (permeabilização celular) e tratamento com a nuclease S1. É importante notar que os controles adequados são obrigatórios, como amostras tratadas com o agente genotóxico, mas sem a nuclease S1 e amostras tratadas com a nuclease S1 sem o agente genotóxico. O próprio protocolo, incluindo a incorporação de análogos, tratamento S1 e disseminação, pode ser realizado em um dia e não requer material excepcional. Requer apenas os análogos de timmidina, a nuclease S1 purificada, os anticorpos primários e secundários apropriados, e um microscópio fluorescente. No geral, a fibra de DNA que emprega o nuclease S1 detecta lacunas ssDNA em garfos de replicação em andamento usando uma abordagem relativamente simples.

As lacunas de DNA pós-replicação formadas como consequência de mecanismos de resposta ao estresse de replicação podem ser reparadas (ou preenchidas) por diferentes mecanismos, incluindo síntese de DNA de translesão ou comutação de modelo, em um processo chamado de preenchimento de lacunas ou reparo pós-replicação (PRR)²⁵. Esses processos ocorrem por trás do avanço dos garfos, envolvendo a síntese de DNA independente da replicação 14,26,27. Com base nesses achados, um esquema de rotulagem distinto do ensaio padrão de fibra de DNA pode ser realizado para visualizar eventos de preenchimento de lacunas na fase G2 diretamente 14,16,26,28. Especificamente, um analógico de timmidina pode ser usado para rotular o garfo de replicação no momento do tratamento genotoxico e a formação de lacunas ssDNA pós-replicação, enquanto outro analógico de timmidina pode ser usado para rotular eventos de preenchimento de lacunas. Neste protocolo, as células são rotuladas com um primeiro analógico de timmidina (UI, por exemplo) imediatamente após ou concomitantemente com tratamento genotóxico por 1h, de modo que o DNA nascente seja rotulado no momento da formação de lacunas. O nocodazol é adicionado após o tratamento para qualquer lugar entre 12-24 h para prender células em G2/M, impedindo a fase S seguinte. Para as últimas 4 horas de tratamento nocodazol, um segundo analógico de timmidina (CLdU, por exemplo) é adicionado à mídia a ser incorporada durante o preenchimento de lacunas. É importante ressaltar que este ensaio só pode ser usado para detectar eventos de preenchimento de lacunas no G2 porque o sinal de preenchimento de lacunas da UIC não pode ser distinguido de um sinal devido à incorporação do CLdU na replicação do DNA na fase S. Portanto, para minimizar o sinal de fundo, o tempo de incorporação da CLDU após indução de danos deve coincidir com quando a maioria da população celular está entrando na fase^{G2 14}. Portanto, esse tempo vai variar dependendo da linha celular e das condições de tratamento. A otimização da progressão do ciclo celular antes de empregar este ensaio é aconselhável. A co-coloração desses análogos de timmidina permite a visualização de tratos de preenchimento de lacunas (manchas de PRR) em cima de DNA nascente (tratos de IdU) sintetizados durante o tratamento genotóxico quando foram geradas lacunas de SSDNA.