هنا نصف تعديلين لفحص ألياف الحمض النووي للتحقيق في فجوات الحمض النووي المفردة في تكرار الحمض النووي بعد تحريض الآفة. يتيح فحص الألياف S1 الكشف عن الفجوات اللاحقة للتكرار باستخدام endonuclease S1 الخاص ب ssDNA ، في حين يسمح فحص ملء الفجوات بالتصور وتحديد كمية إصلاح الفجوة.
فحص ألياف الحمض النووي هو طريقة بسيطة وقوية لتحليل ديناميكيات شوكة النسخ المتماثل ، استنادا إلى الكشف المناعي لنظائر النيوكليوتيدات التي يتم دمجها أثناء تخليق الحمض النووي في الخلايا البشرية. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية لها دقة محدودة تبلغ بضعة آلاف من الكيلوجرامات. وبالتالي ، فإن فجوات الحمض النووي المفردة بعد النسخ المتماثل (ssDNA) التي لا يمكن اكتشافها بواسطة الفحص القياسي. هنا ، نصف نسخة معدلة من فحص ألياف الحمض النووي الذي يستخدم نوكلياز S1 ، وهو إنزيم يشق ssDNA على وجه التحديد. في وجود فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل ، سيستهدف نوكليز S1 الفجوات ويشقها ، مما يولد مساحات أقصر يمكن استخدامها كقراءة لفجوات ssDNA على الشوكات المستمرة. تتشكل فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل عندما يتم تكرار الحمض النووي التالف بشكل متقطع. يمكن إصلاحها عبر آليات غير مقترنة من تكرار الجينوم ، في عملية تعرف باسم سد الفجوة أو إصلاح ما بعد التكرار. نظرا لأن آليات سد الفجوات تنطوي على تخليق الحمض النووي بشكل مستقل عن المرحلة S ، يمكن أيضا استخدام التعديلات في مخطط وضع العلامات على ألياف الحمض النووي لمراقبة أحداث سد الفجوات. إجمالا، هذه التعديلات على فحص ألياف الحمض النووي هي استراتيجيات قوية لفهم كيفية تشكيل الفجوات اللاحقة للتكرار وملئها في جينوم الخلايا البشرية.
قدمت الأعمال المنوية دليلا على تراكم الفجوات الأحادية التي تقطعت بها السبل (ssDNA) بعد النسخ المتماثل عند العلاج بعوامل ضارة بالحمض النووي في البكتيريا1 والخلايا البشرية 2,3. أثناء تكرار قوالب الحمض النووي التالفة ، قد تتجاوز آلية تخليق الحمض النووي الآفات عن طريق استخدام بوليميراز الحمض النووي التخليقي الانتقالي المحدد أو من خلال آليات تبديل القوالب. بدلا من ذلك ، قد يتخطى المضاد ببساطة الآفة تاركا فجوة ssDNA وراءه ، ليتم إصلاحها لاحقا. في الآونة الأخيرة ، أظهرت دراسة بوضوح أن العلاج بالعوامل السامة للوراثة يؤدي إلى فجوات ssDNA في حقيقيات النوى من خلال استخدام المجهر الإلكتروني لتصور البنية المحددة لوسيطات النسخ المتماثل4. اقترح في البداية أن يكون تشكيل هذه المناطق من الفجوات اللاحقة للتكرار نتيجة بسيطة للوضع شبه المتقطع لتكرار الحمض النووي2. في هذه الحالة ، يمكن للآفة الموجودة على الخيط المتخلف أن تمنع استطالة جزء Okazaki ، ولكن يتم إنقاذ تطور الشوكة بشكل طبيعي بواسطة جزء Okazaki التالي ، تاركا وراءه فجوة ssDNA. ومع ذلك ، أظهرت المزيد من الدراسات أن تكوين فجوات على الشريط الرئيسي ممكن أيضا ، كما هو موضح لأول مرة في البكتيريا5. في حقيقيات النوى ، تبين أن PRIMPOL ، وهو بوليميراز فريد من نوعه للحمض النووي مع نشاط بريماز ، قادر على إعادة تشغيل تخليق الحمض النووي في اتجاه مجرى النهر ، وهو آفة تمنع التكرار من خلال نشاط التوبيخ6،7،8،9،10،11. وبالتالي ، فإن نشاط بريماز PRIMPOL قد يفسر تكوين فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل في الشريط الرئيسي عند العلاج بعامل ضار بالحمض النووي في الخلايا البشرية12. ومع ذلك، فإن الكشف عن هذه الفجوات وكذلك إصلاح الفجوات، حتى وقت قريب، كان يتطلب نهجا غير مباشرة أو مستهلكة للوقت مثل المجهر الإلكتروني4 أو المقايسات القائمة على البلازميد13. كان استخدام نوكليز S1 الخاص ب ssDNA للكشف عن الفجوات في الخلايا البشرية رائدا من خلال الدراسات المبكرة منذ أكثر من أربعين عاما ، باستخدام تقنيات تدرج السكروز 2,3. في الآونة الأخيرة ، طبقت مجموعتنا استخدام هذا النوكليز للكشف عن ssDNA في تكرار الحمض النووي (فجوات ما بعد التكرار) باستخدام طرق أخرى مثل ألياف الحمض النووي ومقايسات المذنبات14. وقد مهدت هذه النهج الجديدة الطريق أمام الطفرة الحالية في الدراسات المتعلقة بالفجوات اللاحقة للتكرار. هنا ، نصف استراتيجية لاستخدام نوكليز S1 للكشف عن فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل بواسطة فحص ألياف الحمض النووي ونشرح كيف يمكن لنظام وضع العلامات التفاضلية في بروتوكول ألياف الحمض النووي أن يسمح بدراسة إصلاح هذه الفجوات.
يعد فحص ألياف الحمض النووي تقنية قوية تم استخدامها من قبل عدد متزايد من المختبرات وقدمت رؤى قيمة حول ديناميكيات شوكة النسخ المتماثل وآليات الاستجابة لإجهاد النسخ المتماثل. باختصار ، تعتمد هذه التقنية على الدمج المتسلسل لنظائر النيوكليوتيدات (مثل CldU -5-chloro-2′-deoxyuridine-، و IdU -5-iodo-2′-deoxyuridine) في الحمض النووي المكرر. بعد الحصاد ، يتم تحليل الخلايا ، وتنتشر جزيئات الحمض النووي على شريحة زجاجية مغلفة إيجابيا. ثم يتم الكشف عن CldU و IdU بواسطة أجسام مضادة محددة ، والتي يمكن تصورها في المجهر الفلوري كألياف ثنائية اللون. وأخيرا ، يتم قياس أطوال مسالك IdU و CldU لتحديد أي تغييرات في ديناميكيات تكرار الحمض النووي نتيجة لتحريض تلف الحمض النووي. يمكن استخدام هذه التقنية للتحقيق في ظواهر مختلفة ، مثل توقف الشوكة ، وتباطؤ الشوكة ، وتدهور الحمض النووي الوليد ، والاختلافات في تواتر إطلاق النار الأصلي15,16.
أحد القيود المفروضة على فحص ألياف الحمض النووي هو دقته لبضعة كيلوجرامات. نظرا لأن فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل يمكن أن تكون في نطاق مئات القواعد ، فمن المستحيل تصور هذه الفجوات مباشرة بواسطة بروتوكول ألياف الحمض النووي القياسي. وجود فجوات ssDNA على تكرار الحمض النووي في الخلايا البشرية المعالجة بالعوامل السامة للوراثة كان متورطا بشكل غير مباشر من قبل. على سبيل المثال ، ملاحظة ssDNA كما تم تقييمها من خلال توظيف البروتين المرتبط ب ssDNA ، أو بروتين النسخ المتماثل A (RPA) ، في الخلايا خارج المرحلة S ، أو تكوين ssDNA كما تم اكتشافه بواسطة فك الحمض النووي القلوي جنبا إلى جنب مع عدم وجود توقف شوكة مطول بواسطة فحص ألياف الحمض النووي 12,17,18,19,20,21 يعزى إلى تراكم فجوات الحمض النووي المتنقلة (ssDNA). بالإضافة إلى ذلك ، فإن فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل تحفز نقطة تفتيش مرحلة G2 / M تعتمد على ATR وتوقف الخلايا المعالجة بسموم النسخ المتماثل18،19،20،21،22.
تحلل نوكلياز S1 الأحماض النووية أحادية الخيط التي تطلق 5 ‘-phosphoryl mono- أو oligonucleotides ولها تقارب أعلى 5 مرات مع ssDNA مقارنة بالحمض النووي الريبي. الأحماض النووية المزدوجة (DNA:DNA، DNA:RNA، أو RNA:RNA) مقاومة للنوكليز S1 إلا عند استخدامها بتركيزات عالية للغاية. كما يشق نوكليز S1 الحمض النووي المزدوج في المنطقة الواحدة التي تقطعت بها السبل بسبب أو فجوة أو عدم تطابق أو حلقة. وبالتالي فإن نوكليز S1 هو إندونوكليز خاص ب ssDNA قادر على شق فجوات ssDNA ، مما يؤدي في النهاية إلى توليد فواصل مزدوجة تقطعت بها السبل23,24. وبالتالي ، فإن إضافة خطوات لهضم نوكلياز S1 إلى بروتوكول ألياف الحمض النووي بشكل غير مباشر يمكن من اكتشاف فجوات ssDNA بعد التكرار. في وجود ثغرات ، فإن معالجة النوى المكشوفة باستخدام نوكليز S1 قبل انتشار الحمض النووي ستولد مساحات أقصر نتيجة لانقسام S1 في ssDNA الموجود بطبيعته في الفجوات14. وفقا لذلك ، فإن تقصير المسالك هو القراءة لفجوات ssDNA باستخدام هذا النهج. بالمقارنة مع بروتوكول ألياف الحمض النووي القياسي ، فإن ألياف الحمض النووي مع نوكلياز S1 تتطلب فقط خطوتين إضافيتين: التعرض للنوى (نفاذية الخلية) والعلاج باستخدام نوكلياز S1. ومن المهم ملاحظة أن الضوابط المناسبة إلزامية، مثل العينات المعالجة بالعامل السام الوراثي ولكن بدون نوكليز S1 والعينات المعالجة بنوكليز S1 بدون العامل السام الوراثي. يمكن تنفيذ البروتوكول نفسه ، بما في ذلك دمج النظير ، ومعالجة S1 ، والانتشار ، في يوم واحد ولا يتطلب مواد استثنائية. لا يتطلب سوى نظائر الثيميدين ، ونوكليز S1 المنقى ، والأجسام المضادة الأولية والثانوية المناسبة ، والمجهر الفلوري. بشكل عام ، تكتشف ألياف الحمض النووي التي تستخدم نوكلياز S1 فجوات ssDNA على شوكات النسخ المتماثل المستمرة باستخدام نهج بسيط نسبيا.
يمكن إصلاح (أو ملء) فجوات الحمض النووي عبر الحمض النووي المتماثل التي تشكلت نتيجة لآليات الاستجابة لإجهاد النسخ المتماثل بواسطة آليات مختلفة، بما في ذلك تخليق الحمض النووي العابر للآفة أو تبديل القالب، في عملية تسمى سد الفجوة أو إصلاح ما بعد النسخ المتماثل (PRR)25. تحدث هذه العمليات خلف الشوكات المتقدمة ، والتي تنطوي على تخليق الحمض النووي المستقل عن النسخ المتماثل14،26،27. بناء على هذه النتائج ، يمكن إجراء مخطط وضع العلامات المختلف عن فحص ألياف الحمض النووي القياسي لتصور أحداث سد الفجوات في مرحلة G2 مباشرة14،16،26،28. على وجه التحديد ، يمكن استخدام تناظرية ثيميدين واحدة لتسمية شوكة النسخ المتماثل في وقت العلاج السام وراثيا وتشكيل فجوة ssDNA بعد النسخ المتماثل ، في حين يمكن استخدام تناظرية ثيميدين أخرى لتسمية أحداث ملء الفجوة. في هذا البروتوكول ، يتم تصنيف الخلايا بأول تناظرية ثيميدين (IdU ، على سبيل المثال) مباشرة بعد أو بالتزامن مع العلاج السام الوراثي لمدة 1 ساعة ، بحيث يتم تسمية الحمض النووي الوليد في وقت تكوين الفجوة. يضاف نوكودازول عند العلاج لمدة تتراوح بين 12-24 ساعة لاعتقال الخلايا في G2 / M ، مما يمنع المرحلة S التالية. بالنسبة لآخر 4 ساعات من علاج نوكودازول ، تتم إضافة تناظرية ثيميدين ثانية (CldU ، على سبيل المثال) إلى الوسائط التي سيتم دمجها أثناء ملء الفجوة. الأهم من ذلك ، لا يمكن استخدام هذا الفحص إلا للكشف عن أحداث ملء الفجوة في G2 لأنه لا يمكن تمييز إشارة ملء الفجوة من CldU عن إشارة بسبب دمج CldU في تكرار الحمض النووي في مرحلة S. لذلك ، لتقليل إشارة الخلفية ، يجب أن يتزامن توقيت دمج CldU بعد تحريض الضرر مع الوقت الذي يدخل فيه معظم سكان الخلايا المرحلةG2 14. لذلك ، سيختلف هذا التوقيت اعتمادا على خط الخلية وظروف العلاج. ينصح بتحسين تقدم دورة الخلية قبل استخدام هذا الفحص. يسمح التلطيخ المشترك لهذه النظائر الثيميدين بتصور مسالك ملء الفجوات (PRR) (بقع CldU) فوق الحمض النووي الوليد (IdU tracts) الذي تم تصنيعه أثناء العلاج السام للوراثة عندما تم إنشاء فجوات ssDNA.
نوقشت الخطوات الحاسمة لبروتوكول فحص ألياف الحمض النووي القياسي في منشور سابق32. هنا ، نصف الإصدارات المعدلة من فحص ألياف الحمض النووي القياسي للتحقيق في وجود فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل وكذلك إصلاحها عن طريق ملء الفجوات ، الموصوفة في البداية في14. في سياق وجود فجو…
The authors have nothing to disclose.
يتم دعم العمل في مختبر C.F.M.M. من قبل Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP ، ساو باولو ، البرازيل ، المنح # 2019/19435-3 ، # 2013/08028-1 و 2017/05680-0) في إطار أبحاث التعاون الدولي من FAPESP والمنظمة الهولندية للبحث العلمي (NWO ، هولندا) ؛ Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazil, Grants # 308868/2018-8] و Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazil, Financial Code 001).
Acetic acid, Glacial | Synth | 64-19-7 | Alternatively, BSA – Biosera – REF PM-T1725/100 |
Ammonium hydroxide | Synth | 1336-21-6 | Or similar |
Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | – |
Antibody anti-rat Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21470 | – |
Antibody Mouse anti-BrdU | Becton Disckson | 347580 | – |
Antibody Rat anti-BrdU | Abcam | Ab6326 | – |
Biological security hood | Pachane | PA 410 | Use hood present in the laboratory |
BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3294 | Or similar |
Cell scraper | Thermo Scientific | 179693 | Or similar |
CldU | Millipore-Sigma | C6891 | – |
Cloridric acid | Synth | 7647-01-0 | Or similar |
Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9) | Zeiss | – | Or similar |
Cover glass (or coverslips) | Thermo Scientific | 152460 | Alternatively, Olen – Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) – K5-2460 |
DMEM – High Glucose | LGC/Gibco | BR30211-05/12100046 | Use culture media specific for the cell line used. |
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Sigma-Aldrich | E5314 | Or similar |
Epifluorescence Microscope Axiovert 200 | Zeiss | – | Or similar |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 12657-029 | Or similar |
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific 3110 | 13-998-074 | Use cell incubator present in the laboratory |
Glass slide jar | Sigma-Aldrich | S5516 | Or similar |
Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | Or similar |
Idu | Millipore-Sigma | I7125 | – |
Magnesium Chloride | Synth | 7791-18-6 | Or similar |
Methanol | Merck | 67-56-1 | Or similar |
Microscope slides | Denville | M1021 | Alternatively, Olen – Kasvi Microscope Slides – K5-7105 OR Precision Glass Line – 7105-1 |
MOPS (Ácido 3-morfolinopropano 1-sulfônico) | Synth | 1132-61-2 | Or similar |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | 31430-18-9 | – |
PBS (Phosphate Buffer Saline) | Life Thechnologies | 3002 | Or similar |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Or similar |
ProLong Gold AntiFade Mountant | Invitrogen | P36930 | Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used |
S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae | Invitrogen | 18001-016 | Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 – 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 °C |
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | BioRad | 161-0302 | Or similar |
Sodium Acetate Trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-90-4 | Or similar |
Sodium Chloride | Synth | 7647-14-5 | Or similar |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | Or similar |
Tris Base | West Lab Research | BP152-1 | Or similar |
Triton X-100 | Synth | 9002-93-1 | Or similar |
Trypsin | Gibco | 25200072 | Or similar |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Or similar |
UVC Lamp | Non Specific | – | Essential: emission lenght of 254 nm |
VLX-3W UV Radiometer | Vilber Loumart | – | Or similar |
Zinc Acetate | Sigma-Aldrich | 557-34-6 | Or similar |