Обнаружение пострепликативного накопления и восстановления разрывов в клетках человека с помощью анализа волокон ДНК

Основополагающие работы предоставили доказательства накопления пострепликативных одноцепочечных (ssDNA) пробелов при лечении агентами, повреждающими ДНК, в бактериях¹ и клетках человека ^2,3. Во время репликации поврежденных шаблонов ДНК механизм синтеза ДНК может обходить поражения, используя специфические транслейсионные синтезные ДНК-полимеразы или с помощью механизмов переключения шаблонов. В качестве альтернативы, реплисома может также просто пропустить поражение, оставив зазор ssDNA позади, чтобы быть восстановленным позже. Совсем недавно исследование ясно показало, что лечение генотоксическими агентами приводит к разрывам ssDNA у эукариот с использованием электронной микроскопии для визуализации специфической структуры промежуточных продуктов репликации⁴. Формирование этих областей пострепликативных промежутков первоначально предполагалось как простой результат полупереключенного способа репликации ДНК². В этом случае поражение на запаздывающей нити может блокировать удлинение фрагмента Окадзаки, но прогрессирование вилки естественным образом спасается следующим фрагментом Окадзаки, оставляя после себя разрыв сдНК. Однако дальнейшие исследования показали, что образование промежутков на ведущей нити также возможно, как впервые показано у бактерий⁵. Было показано, что у эукариот PRIMPOL, уникальная ДНК-полимераза с активностью примазы, способна возобновить синтез ДНК после репликации, блокирующей поражение через ее выговорную активность 6,7,8,9,10,11. Таким образом, активность примазы PRIMPOL может объяснить образование пострепликативных разрывов ссДНК в ведущей цепи при лечении повреждающим ДНК агентом в клетках человека¹². Тем не менее, обнаружение этих пробелов, а также восстановление зазоров до недавнего времени требовало косвенных или трудоемких подходов, таких как электронная микроскопия⁴ или анализы на основе плазмид¹³. Использование специфической для ssDNA нуклеазы S1 для обнаружения пробелов в клетках человека было впервые предложено ранними исследованиями более сорока лет назад с использованием методов градиента сахарозы ^2,3. Совсем недавно наша группа применила использование этой нуклеазы для обнаружения ssDNA в репликации ДНК (пострепликтивные промежутки) с использованием других методов, таких как ДНК-волокно и кометные анализы¹⁴. Эти новые подходы проложили путь к нынешнему всплеску исследований пострепликационных пробелов. Здесь мы описываем стратегию использования нуклеазы S1 для обнаружения пострепликативных разрывов ssDNA с помощью анализа волокон ДНК и объясняем, как схема дифференциальной маркировки в протоколе волокна ДНК может позволить изучить восстановление этих пробелов.

Анализ волокон ДНК является мощным методом, который используется растущим числом лабораторий и дает ценную информацию о динамике репликационной вилки и механизмах реакции на стресс репликации. Вкратце, этот метод основан на последовательном включении аналогов нуклеотидов (таких как CldU -5-хлор-2′-дезоксиуридин- и IdU-5-йодо-2′-дезоксиуридин) в реплицирующуюСЯ ДНК. После сбора клеток лизируют, а молекулы ДНК распространяются на стеклянном предметном стекле с положительным покрытием. CldU и IdU затем обнаруживаются специфическими антителами, которые могут быть визуализированы в флуоресцентном микроскопе в виде двухцветных волокон. Наконец, длины трактов IdU и CldU измеряются для выявления любых изменений динамики репликации ДНК в результате индукции повреждения ДНК. Этот метод может быть использован для исследования различных явлений, таких как сваливание вилки, замедление вилки, зарождающаяся деградация ДНК и вариации частоты запуска источника^15,16.

Одним из ограничений анализа волокна ДНК является его разрешение в несколько килобаз. Поскольку пострепликтивные пробелы ssDNA могут находиться в диапазоне сотен оснований, невозможно визуализировать эти промежутки непосредственно по стандартному протоколу волокна ДНК. Наличие пробелов ssDNA в репликации ДНК в клетках человека, обработанных генотоксическими агентами, косвенно упоминалось ранее. Например, наблюдение за ssDNA, оцениваемой по набору ssDNA-связывающего белка, репликационного белка A (RPA) в клетках вне S-фазы или образованию ssDNA, обнаруженному при раскручивании щелочной ДНК в сочетании с отсутствием длительного сваливания вилки анализом ^{днк-волокна} 12,17,18,19,20,21 было связано с накоплением пробелов в сдНК. Кроме того, пострепликтивные разрывы ssDNA индуцируют ATR-зависимую контрольную точку фазы G2/M и арест клеток, обработанных ядами репликации 18,19,20,21,22.

Нуклеаза S1 разлагает одноцепочечные нуклеиновые кислоты, высвобождая 5′-фосфорилмоно- или олигонуклеотиды, и имеет в 5 раз более высокое сродство к ssDNA по сравнению с РНК. Двухцепочечные нуклеиновые кислоты (ДНК: ДНК, ДНК: РНК или РНК: РНК) устойчивы к нуклеазе S1, за исключением случаев, когда они используются в чрезвычайно высоких концентрациях. Нуклеаза S1 также расщепляет двухцепочечную ДНК в одноцепочечной области, вызванной ником, разрывом, несоответствием или петлей. Таким образом, нуклеаза S1 представляет собой специфическую для ssDNA эндонуклеазу, способную расщеплять промежутки ssDNA, в конечном итоге генерируя двухцепочечные разрывы^23,24. Таким образом, добавление шагов для переваривания нуклеазы S1 в протокол волокна ДНК косвенно позволяет обнаружить пострепликтивные пробелы ssDNA. При наличии пробелов обработка открытых ядер нуклеазой S1 до распространения ДНК будет генерировать более короткие тракты в результате расщепления SsDNA SsDNA, по своей сути присутствующего в промежутках¹⁴. Соответственно, сокращение тракта является считыванием пробелов в СДНК с использованием этого подхода. По сравнению со стандартным протоколом ДНК-волокна, ДНК-волокно с нуклеазой S1 требует только двух дополнительных этапов: воздействия на ядра (клеточная пермеабилизация) и лечения нуклеазой S1. Важно отметить, что соответствующие средства контроля являются обязательными, такие как образцы, обработанные генотоксическим агентом, но без нуклеазы S1, и образцы, обработанные нуклеазой S1 без генотоксического агента. Сам протокол, включая включение аналогов, обработку S1 и распространение, может быть выполнен за один день и не требует исключительного материала. Для этого требуются только аналоги тимидина, очищенная нуклеаза S1, соответствующие первичные и вторичные антитела и флуоресцентный микроскоп. В целом, днк-волокно, использующее нуклеазу S1, обнаруживает пробелы ssDNA на текущих репликационных вилках, используя относительно простой подход.

Пострепликтивные пробелы сдНК, образовавшиеся в результате механизмов реакции на стресс репликации, могут быть восстановлены (или заполнены) различными механизмами, включая транслейционный синтез ДНК или переключение шаблонов, в процессе, называемом заполнением пробелов или пострепликационным восстановлением (PRR)²⁵. Эти процессы происходят за наступающими форками, включая репликационно-независимый синтез ДНК 14,26,27. Основываясь на этих результатах, схема маркировки, отличная от стандартного анализа волокна ДНК, может быть выполнена для визуализации событий заполнения пробелов в фазе G2 непосредственно 14,16,26,28. В частности, один аналог тимидина может быть использован для маркировки репликационной вилки во время генотоксического лечения и пострепликтивного образования пробелов сдДНК, в то время как другой аналог тимидина может быть использован для маркировки событий заполнения пробелов. В этом протоколе клетки маркируются первым аналогом тимидина (например, IdU) сразу после или одновременно с генотоксическим лечением в течение 1 ч, так что зарождающаяся ДНК мечится в момент образования разрыва. Нокодазол добавляют после лечения в течение 12-24 ч для ареста клеток в G2 / M, предотвращая следующую S-фазу. В течение последних 4 ч лечения нокодазолом второй аналог тимидина (cldU, например) добавляют в среду, которая будет включена во время заполнения пробелов. Важно отметить, что этот анализ может быть использован только для обнаружения событий заполнения пробелов в G2, поскольку сигнал заполнения пробелов от CldU не может быть отличим от сигнала из-за включения CldU в репликацию ДНК в S-фазе. Поэтому, чтобы свести к минимуму фоновый сигнал, время включения CldU после индукции повреждения должно совпадать с тем, когда большая часть клеточной популяции входит в фазу G2¹⁴. Поэтому эти сроки будут варьироваться в зависимости от клеточной линии и условий лечения. Рекомендуется оптимизировать прогрессию клеточного цикла перед использованием этого анализа. Совместное окрашивание этих аналогов тимидина позволяет визуализировать участки, заполняющие пробелы (PRR) (пластыри CldU) поверх зарождающейся ДНК (тракты IdU), синтезированной во время генотоксического лечения, когда были созданы пробелы ssDNA.