Detectie van post-replicatieve hiaten accumulatie en reparatie in menselijke cellen met behulp van de DNA-vezeltest

Baanbrekende werken hebben bewijs geleverd van de accumulatie van post-replicatieve enkelstrengs (ssDNA) hiaten bij behandeling met DNA-schadelijke stoffen in bacteriën¹ en menselijke cellen ^2,3. Tijdens de replicatie van beschadigde DNA-sjablonen kan de DNA-synthesemachine de laesies omzeilen door gebruik te maken van specifieke translesiesynthese DNA-polymerasen of door sjabloonschakelmechanismen. Als alternatief kan het replisoom ook gewoon de laesie overslaan en een ssDNA-opening achterlaten, om later te worden gerepareerd. Meer recent toonde een studie duidelijk aan dat behandeling met genotoxische middelen leidt tot ssDNA-hiaten in eukaryoten door gebruik te maken van elektronenmicroscopie om de specifieke structuur van replicatietussenproducten te visualiseren⁴. De vorming van deze gebieden van post-replicatieve hiaten werd aanvankelijk voorgesteld als een eenvoudig resultaat van de semi-discontinue modus van DNA-replicatie². In dit geval kan een laesie op de achterblijvende streng de verlenging van een Okazaki-fragment blokkeren, maar vorkprogressie wordt op natuurlijke wijze gered door het volgende Okazaki-fragment, waardoor een ssDNA-opening achterblijft. Verdere studies toonden echter aan dat de vorming van gaten op de leidende streng ook mogelijk is, zoals voor het eerst aangetoond bij bacteriën⁵. In eukaryoten bleek PRIMPOL, een uniek DNA-polymerase met primase-activiteit, in staat om de DNA-synthese stroomafwaarts van een replicatieblokkerende laesie te herstarten door zijn repriming-activiteit 6,7,8,9,10,11. De PRIMPOL primase-activiteit kan dus de vorming van postreplicerende ssDNA-hiaten in de leidende streng verklaren bij behandeling met een DNA-beschadigend middel in menselijke cellen¹². Niettemin vereiste de detectie van deze hiaten en het repareren van spleten tot voor kort indirecte of tijdrovende benaderingen zoals elektronenmicroscopie⁴ of op plasmide gebaseerde assays¹³. Het gebruik van het ssDNA-specifieke S1-nuclease om hiaten in menselijke cellen te detecteren, werd meer dan veertig jaar geleden gepionierd door vroege studies, met behulp van sucrosegradiënttechnieken ^2,3. Meer recent heeft onze groep het gebruik van dit nuclease toegepast om ssDNA te detecteren bij het repliceren van DNA (post-replicatieve hiaten) met behulp van andere methoden zoals DNA-vezel en komeettests¹⁴. Deze nieuwe benaderingen maakten de weg vrij voor de huidige golf van studies over post-replicatieve hiaten. Hier beschrijven we een strategie van het gebruik van S1-nuclease om postreplicatieve ssDNA-hiaten te detecteren door DNA-vezeltest en leggen we uit hoe een differentieel etiketteringsschema in het DNA-vezelprotocol de studie van de reparatie van deze hiaten mogelijk kan maken.

De DNA-vezeltest is een krachtige techniek die door een groeiend aantal laboratoria is gebruikt en waardevolle inzichten heeft opgeleverd in replicatievorkdynamiek en replicatiestressresponsmechanismen. In het kort is deze techniek gebaseerd op de sequentiële opname van nucleotide-analogen (zoals CldU -5-chloor-2′-deoxyuridine- en IdU -5-jood-2′-deoxyuridine) in het replicerende DNA. Na het oogsten worden cellen gelyseerd en verspreiden DNA-moleculen zich op een positief gecoate glazen dia. CldU en IdU worden vervolgens gedetecteerd door specifieke antilichamen, die in een fluorescerende microscoop kunnen worden gevisualiseerd als tweekleurige vezels. Ten slotte worden de lengtes van de IdU- en CldU-kanalen gemeten om eventuele veranderingen in de DNA-replicatiedynamiek als gevolg van DNA-schade-inductie te identificeren. Deze techniek kan worden gebruikt om verschillende verschijnselen te onderzoeken, zoals vork stalling, vorkvertraging, ontluikende DNA-afbraak en variaties in de frequentie van oorsprong die wordt afgevuurd^15,16.

Een beperking van de DNA-vezeltest is de resolutie van een paar kilobases. Omdat post-replicatieve ssDNA-hiaten zich in het bereik van honderden basen kunnen bevinden, is het onmogelijk om deze hiaten rechtstreeks te visualiseren met het standaard DNA-vezelprotocol. De aanwezigheid van ssDNA-hiaten bij het repliceren van DNA in menselijke cellen die zijn behandeld met genotoxische middelen is eerder indirect betrokken geweest. Bijvoorbeeld, de observatie van ssDNA zoals beoordeeld door rekrutering van het ssDNA-bindende eiwit, replicatie-eiwit A (RPA), in cellen buiten de S-fase, of de vorming van ssDNA zoals gedetecteerd door alkalische DNA-afwikkeling in combinatie met de afwezigheid van langdurige vorkblokkering door DNA-vezeltest 12,17,18,19,20,21 werd toegeschreven aan de accumulatie van ssDNA-hiaten. Bovendien induceren postreplicatieve ssDNA-hiaten een ATR-afhankelijk G2 / M-fasecontrolepunt en arresteren cellen behandeld met replicatiegif 18,19,20,21,22.

Het S1-nuclease degradeert enkelstrengs nucleïnezuren die 5′-fosforylmono- of oligonucleotiden afgeven en heeft een 5-keer hogere affiniteit met ssDNA in vergelijking met RNA. Dubbelstrengs nucleïnezuren (DNA:DNA, DNA:RNA of RNA:RNA) zijn resistent tegen het S1-nuclease, behalve wanneer ze in extreem hoge concentraties worden gebruikt. De S1-nuclease splijt ook dubbelstrengs DNA in het enkelstrengsgebied veroorzaakt door een nick, gap, mismatch of lus. Het S1-nuclease is dus een ssDNA-specifiek endonuclease dat in staat is om ssDNA-openingen te splijten, waardoor uiteindelijk dubbelstrengsbreuken^{van 23,24} worden gegenereerd. Het toevoegen van stappen voor S1-nucleasevertering aan het DNA-vezelprotocol maakt dus indirect de detectie van postreplicatieve ssDNA-hiaten mogelijk. In aanwezigheid van hiaten zal de behandeling van blootgestelde kernen met het S1-nuclease voorafgaand aan DNA-verspreiding kortere kanalen genereren als gevolg van S1-splitsing van ssDNA die inherent aanwezig is bij hiaten¹⁴. Dienovereenkomstig is traktaatverkorting de uitlezing voor ssDNA-hiaten met behulp van deze aanpak. In vergelijking met het standaard DNA-vezelprotocol vereist de DNA-vezel met het S1-nuclease slechts twee extra stappen: blootstelling aan kernen (celpermeabilisatie) en behandeling met het S1-nuclease. Het is belangrijk op te merken dat passende controles verplicht zijn, zoals monsters die zijn behandeld met het genotoxische middel maar zonder het S1-nuclease en monsters die zijn behandeld met het S1-nuclease zonder het genotoxische middel. Het protocol zelf, inclusief de integratie van analogen, S1-behandeling en verspreiding, kan in één dag worden uitgevoerd en vereist geen uitzonderlijk materiaal. Het vereist alleen de thymidine-analogen, het gezuiverde S1-nuclease, de juiste primaire en secundaire antilichamen en een fluorescerende microscoop. Over het algemeen detecteert de DNA-vezel die de S1-nuclease gebruikt ssDNA-hiaten op lopende replicatievorken met behulp van een relatief eenvoudige aanpak.

De postreplicatieve ssDNA-hiaten die zijn gevormd als gevolg van replicatiestressresponsmechanismen kunnen worden gerepareerd (of opgevuld) door verschillende mechanismen, waaronder translesie-DNA-synthese of sjabloonschakeling, in een proces dat gap-filling of post-replication repair (PRR)²⁵ wordt genoemd. Deze processen vinden plaats achter de voortschrijdende vorken, waarbij replicatie-onafhankelijke DNA-synthese 14,26,27 ^{betrokken is}. Op basis van deze bevindingen kan een etiketteringsschema worden uitgevoerd dat verschilt van de standaard DNA-vezeltest om gap-filling events in de G2-fase direct^{te visualiseren} 14,16,26,28. In het bijzonder kan één thymidine-analoog worden gebruikt om de replicatievork te labelen op het moment van genotoxische behandeling en postreplicatieve ssDNA-gapvorming, terwijl een ander thymidine-analoog kan worden gebruikt om gap-filling events te labelen. In dit protocol worden cellen gelabeld met een eerste thymidine-analoog (IdU, bijvoorbeeld) onmiddellijk na of gelijktijdig met genotoxische behandeling gedurende 1 uur, zodat het ontluikende DNA wordt gelabeld op het moment van gap-vorming. Nocodazol wordt toegevoegd na behandeling gedurende ergens tussen 12-24 uur om cellen in G2 / M te stoppen, waardoor de volgende S-fase wordt voorkomen. Voor de laatste 4 uur nocodazolbehandeling wordt een tweede thymidine-analoog (CldU, bijvoorbeeld) toegevoegd aan de media om te worden opgenomen tijdens het vullen van gaten. Belangrijk is dat deze test alleen kan worden gebruikt om gap-filling events in G2 te detecteren, omdat het gap-filling signaal van CldU niet kan worden onderscheiden van een signaal als gevolg van CldU-integratie in replicerend DNA in de S-fase. Daarom, om het achtergrondsignaal te minimaliseren, moet de timing van CldU-opname na schade-inductie samenvallen met wanneer het grootste deel van de celpopulatie de G2-fase¹⁴ binnengaat. Daarom zal deze timing variëren afhankelijk van de cellijn en de behandelingsomstandigheden. Het optimaliseren van de progressie van de celcyclus voorafgaand aan het gebruik van deze test wordt geadviseerd. Co-kleuring van deze thymidine-analogen maakt de visualisatie mogelijk van gap-filling (PRR) tracts (CldU-patches) bovenop ontluikend DNA (IdU-kanalen) gesynthetiseerd tijdens de genotoxische behandeling wanneer ssDNA-hiaten werden gegenereerd.