Kantitatif Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonunun Böbrekte ve Serumda Yaşa Bağlı Böbrek Yetmezliği Olan Farelerin Serumunda Değerlendirilmesi

Deneysel protokol, Jichi Tıp Üniversitesi Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylanmış ve Jichi Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Kılavuzu ve deney hayvanlarının kullanımı ve bakımı ile ilgili kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu protokol dört adet 50 haftalık SAMR1 erkek fare ve SAMP1 erkek fare (40-45 g) kullanır. 1. Serum numune toplama Her fare için aşağıdakileri hazırlayın: 1,0 mL şırıngalı 30 G iğne, heparinli 1,0 mL spitz santrifüj tüpü, 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri, izofluran anestezik, mantar tabakası, etanol, fosfat tamponlu salin (PBS) ile nemlendirilmiş iki pamuklu çubuk, PBS’li bir Petri kabı, cımbız ve cerrahi makas. Fareyi% 1.5 izofluran ile anestezi altına alın ve% 1.5’te tutun. Bir analjezik (Meloksikam 5 mg / kg) deri altından uygulayın, daha sonra karnına 1.0 mL% 70 etanol enjekte edin ve mantar tabakası üzerinde sırtüstü pozisyona yerleştirin. Pedal çekilme refleksinin kaybolmasıyla anestezi derinliğini onaylayın. Cımbız ve cerrahi makas ile karın derisini kesin. Kasları ve periton zarını mesaneden kaburgaların sol alt kenarına kadar kesin. Periton zarını kaldırmak için cımbızı kullanın ve cerrahi makasla periton zarının üst kenarında yanal bir kesi yapın. Kaburgaların en alt kenarı boyunca insizyona devam edin. İki PBS nemlendirilmiş pamuklu çubuk kullanarak inferior vena kavayı tanımlayın. 1.0 mL şırınga ile 30 G iğnelerden birini inferior vena kavaya yerleştirin ve ardından şırıngayı çekin. Hemolizi önlemek için iğneyi inferior vena kavadan yavaşça çekin. Kanı heparin ile 1.0 mL spitz tüpüne aktarın ve daha sonra tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın.NOT: Fare servikal çıkık ile ötenazi yapılır. Spitz tüpünü oda sıcaklığında (RT), 10 dakika boyunca 3.000 × g döndürün. Süpernatantı yavaşça aspire edin, tortu içermediğinden emin olun ve ardından kullanılmayan 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Kullanmadan önce tüpü -80 ° C’de saklayın.NOT: Hemen Adım 3’e geçerseniz, tüpün -80 ° C’de saklanmasına gerek yoktur. 2. Böbrek örneği toplama Her fare için aşağıdakileri hazırlayın: 2.0 mL kriyotüpler, izofluran anestezik, mantar tabakası,% 70 etanol, PBS’li bir Petri kabı, cımbız ve cerrahi makas. Fareyi% 1.5 izofluran ile anestezi altına alın ve% 1.5’te tutun. Bir analjezik (Meloksikam 5 mg / kg) deri altından uygulayın, daha sonra karnına 1.0 mL% 70 etanol enjekte edin ve mantar tabakası üzerinde sırtüstü pozisyona yerleştirin. Pedal çekilme refleksinin kaybolmasıyla anestezi derinliğini onaylayın. Karın derisinde bir kesi yapmak için cımbız ve cerrahi makas kullanın. Kasları ve periton zarını mesaneden kaburgaların sol alt kenarına kadar kesin. Periton zarını kaldırmak için cımbızı kullanın ve cerrahi makasla periton zarının üst kenarında yanal bir kesi yapın. Kaburgaların en alt kenarı boyunca insizyona devam edin. Sol böbreği tanımlayın. Böbrek sarımsı-beyaz bir renge dönene kadar kanı damarlardan temizlemek için PBS ile reflü. Sol renal arteri ve damarı koparmak için önce cerrahi makas kullanarak tüm böbreği tüketin. Böbreği bir Petri kabına yerleştirin ve PBS ile dikkatlice yıkayın.NOT: Fare servikal çıkık ile ötenazi yapılır. Böbreği 10 mg’lık örneklere kesmek için cımbızları ve cerrahi makası kullanın (10 mg, bir sonraki adım için uygun bir örneklem boyutudur). Böbreğin her bir örneğini kendi 2.0 mL kriyotüpüne yerleştirin. Tüpün kapağını kapatın. Uzun süreli depolama için, her kriyotüpü sıvı nitrojene aktarın ve -80 ° C’de saklayın. 3. Bir serum örneğinden toplam RNA ekstraksiyonu Önce aşağıdaki maddeleri hazırlayın: bir vorteks karıştırıcı, fenol/guanidin bazlı lizis reaktifi,% 80 etanol,% 100 etanol,% 100 kloroform, biyopolimer spin kolonları (2.0 mL toplama tüplerinde11), membran ankrajlı spin kolonları (2.0 mL toplama tüplerinde11), yıkama tamponu #1 (yani, 1: 2 oranında guanidin ve% 100 etanol içeren yıkama tamponu), yıkama tamponu #2 (yani, 1:4 oranında guanidin ve% 100 etanol içeren yıkama tamponu), RNaz içermeyen su, 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve 2.0 mL mikrosantrifüj tüpleri. İlk olarak, 1.5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpünde 200 μL’lik bir serum örneği alın ve ardından fenol / guanidin bazlı lizis reaktifinin 1.000 μL’sini ekleyin. Karışımı 5 s için vorteks. Numuneyi RT’de 5 dakika boyunca inkübe edin. Tüpteki serum örneğine 200 μL kloroform ekleyin ve tüp kapağını sıkıca kapatın. Kloroform ve serum örneğini karıştırmak için tüpü 15x ters çevirin. Her numune RT’de 3 dakika boyunca inkübe edilir. Ardından, numuneyi 4 ° C’de 12.000 x g’de 15 dakika boyunca döndürün. 300 μL süpernatantı peleti rahatsız etmeden yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 450 μL% 100 etanol ekleyin ve tüpü 5 s boyunca vorteksleyin.NOT: Aşağıdaki tüm adımlarda, RNA ve DNA’nın ayrılması için membranla ankrajlı spin kolonunu santrifüj etmek için 2,0 mL’lik bir toplama tüpüne yerleştirin. Ardından, numunenin 700 μL’sini çıkarın, membranla ankrajlı bir sıkma kolonuna yükleyin ve kapağı kapatın. RT’deki sütunu 8.000 × g’de 15 sn döndürün ve süpernatantı sütunda bırakın. Toplama tüpünde kalan peleti atın. Serum/plazma kitinin bir parçası olan 700 μL yıkama tamponu #1’i membrana tutturulmuş spin kolonuna ekleyerek numuneyi iyice temizleyin. Sütun kapağını kapatın ve RT’deki sütunu 8.000 × g’de 15 sn döndürün ve süpernatantı sütunda bırakın. Toplama tüpünde kalan peleti atın. İz tuzların uzaklaştırılması için, 500 μL yıkama tamponu #2 alın ve membranla ankrajlı bir sıkma kolonuna yükleyin. Sütun kapağını kapattıktan sonra, RT’deki sütunu 8.000 × g’de 15 sn döndürün ve süpernatantı sütunda bırakın. Peleti toplama tüpüne atın. İz tuzların uzaklaştırılması için, 500 μL% 80 etanol alın ve membranla ankrajlı bir spin kolonuna yükleyin. Sütun kapağını kapattıktan sonra, RT’deki sütunu 8.000 × g’de 15 sn döndürün ve süpernatantı sütunda bırakın. Peleti toplama tüpüne atın. Membranla ankrajlı spin kolonunu RT’de 15.000 × g’da 5 dakika boyunca tekrar döndürün. Membranla ankrajlı spin kolonunu yeni bir 1,5 mL toplama tüpüne aktardıktan sonra, toplam RNA’yı çözmek için kolona 14 μL RNaz içermeyen su ekleyin. Sütun kapağını kapattıktan sonra, tüp RT’de bırakılarak 5 dakika bekleyin. sütunu RT’de 15.000 × g’de 1 dakika boyunca tekrar döndürün. Tüpleri kullanmadan önce numunelerle -80 ° C’de saklayın. 4. Bir böbrek örneğinden toplam RNA’nın ekstraksiyonu Önce aşağıdaki maddeleri hazırlayın: bir silikon homojenizatör, buz, bir vorteks karıştırıcı,% 100 etanol,% 100 kloroform, biyopolimer spin kolonları (2.0 mL toplama tüplerinde11), membran ankrajlı spin kolonları (2.0 mL toplama tüplerinde11), fenol / guanidin bazlı lizis reaktifi, yıkama tamponu #1 (Adım 3.1 ile aynı tampon), yıkama tamponu #2 (Adım 3.1 ile aynı tampon), RNaz içermeyen su, 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve 2,0 mL mikrosantrifüj tüpleri. Silikon homojenizatöre 10 mg’lık bir böbrek örneği yerleştirin ve 700 μL fenol / guanidin bazlı lizis reaktifi ekleyin. Homojenizatörü kurun. Numuneyi homojenize etmek için homojenizatörün havanesini böbrek örneğine hafifçe bastırın ve bükün. Böbrek örneği fenol / guanidin bazlı lizis reaktifinde tamamen homojenize olana kadar havaneyi bastırmaya ve bükmeye devam edin. Daha fazla homojenizasyon için, homojenize lizatı (2.0 mL’lik bir toplama tüpünde) alın ve bir biyopolimer spin kolonuna aktarın. RT’deki homojenize lizatı 14.000 × g’da 3 dakika boyunca santrifüj edin ve daha sonra çökeltilmiş peleti ters çevirmek için tüm çökeltilmiş peleti kullanılmayan 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın Peleti tüp içinde 140 μL kloroform ile karıştırın; Ardından, tüp kapağını sıkıca kapatın. Lisat ve kloroformu karıştırmak için tüpü 15x ters çevirin.NOT: Kloroform, başlık olmadan güvenle kullanılabilir. Numuneyi RT’de 2-3 dakika boyunca inkübe edin. Numuneyi 4 ° C’de 12.000 × g’da 15 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı (genellikle ~ 300 μL) çökeltiyi bozmadan yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. % 100 etanolün hacminin 1,5 katını (genellikle ~ 450 μL) ekleyin. Karışımı 5 s için vorteks.NOT: Aşağıdaki adımların hepsinde, RNA ve DNA’yı ayırmak için membrana implante spin kolonunu santrifüj etmek için 2,0 mL’lik bir toplama tüpüne yerleştirin. 700 μL numuneyi membran ankrajlı spin kolonlarından birine yükleyin. Kapağı kapatın ve sütunu 15 s için 15.000 × g’de santrifüj yapın. Toplama tüpünde kalan çökelmiş lizatı atın. İyice yıkamak için sıkma kolonuna 700 μL yıkama tamponu #1 ekleyin. Kapağı kapatın ve sütunu 15 s için 15.000 × g’de santrifüj yapın. Toplama tüpünde kalan çökelmiş lizatı atın. Eser miktarda tuzun uzaklaştırılması için, membrana implante edilmiş sıkma kolonuna 500 μL yıkama tamponu #2 yükleyin. Sütun kapağını kapattıktan sonra, sütunu 15 s için 15.000 × g’de santrifüj yapın. Çökeltilmiş lizatı toplama tüpüne atın. Adım 4.11’i tekrarlayın. Membranla ankrajlı spin kolonunu 15.000 × g’da 1 dakika boyunca tekrar santrifüj yapın. Çökeltilmiş lizatı toplama tüpüne atın. Membranla ankrajlı spin kolonunu alın ve yeni bir 1,5 mL toplama tüpüne aktarın. Toplam RNA’yı çözmek için kolona 30 μL RNaz içermeyen su ekleyin. Kolonun kapağını kapattıktan sonra, RT’deki tüp ile 5 dakika bekleyin ve ardından sütunu 15.000 × g’de 1 dakika boyunca santrifüj edin. Toplam RNA içeren numunenin toplam hacmini yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpü buzun üzerine yerleştirin ve spektrofotometri ile toplam RNA konsantrasyonunu ölçün. Toplam RNA konsantrasyonunun ~ 300-1.500 ng / μL olduğundan emin olun. Numune içeren tüpleri kullanmadan önce -80 °C’de saklayın. 5. Serumda total RNA’nın ters transkripsiyonu ile cDNA sentezi NOT: Kantitatif gerçek zamanlı PCR deneyleri (MIQE) kılavuzlarının yayınlanması için asgari bilgi, güvenilir, kesin sonuçlar elde etmek için daha iyi deneysel uygulamaların kullanılmasını önermektedir17. Bu protokolde, cDNA, ters transkriptaz, poli (A) polimeraz ve oligo-dT primerleri kullanılarak iki aşamalı bir prosedürde saflaştırılan toplam RNA’dan sentezlenir. Önce aşağıdakileri hazırlayın: bir vorteks karıştırıcı, bir termal döngüleyici, sekiz delikli şerit tüpler, her sekiz şeritli tüpün kapağı, damıtılmış su, buz, ters transkriptaz kiti (Malzeme Tablosuna bakınız)13,14 erimiş durumda ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri. Termal döngüleyiciyi başlatın. Ana karışım çözeltisini hazırlayın; sekiz delikli şerit tüp başına toplam 8.0 μL ana karışım elde etmek için, 1.5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpünde 4.0 μL ters transkripsiyon tamponuna 2.0 μL ters transkriptaz karışımı (kit içinde dahil) ve 2.0 μL 10x nükleik asit karışımı ekleyin. Ana karışım çözeltisinin 8.0 μL’sini sekiz delikli bir şerit tüpün her bir tüpüne yerleştirin. Sekiz delikli şerit tüpün her tüpüne 12 μL’lik bir toplam RNA alikotu yerleştirin ve tüpün kapağını kapatın. Tüpü RT’de 15 sn ve 2.000 × g için santrifüj yapın. Tüpü termal döngüye yerleştirin ve 37 ° C’de 60 dakika boyunca inkübe edin. cDNA’yı sentezlemek için numuneyi 95 °C dakikada 5 dakika daha inkübe edin. Kuluçkayı takiben, cDNA’yı yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. cDNA’yı on kat (1:10) damıtılmış suyla seyreltin. Vorteks ve tüpü RT’de 5 s ve 2.000 × g için santrifüj yapın. Seyreltilmiş cDNA’yı geçici olarak buz üzerinde saklayın. Seyreltilmiş numuneleri kullanmadan önce -80 ° C’de saklayın. 6. Böbrekte toplam RNA’nın ters transkripsiyonu ile cDNA sentezi NOT: MIQE kılavuzları, güvenilir ve kesin sonuçlar elde etmek için daha iyi deneysel uygulamaları teşvik etmektedir17. Bu protokol, iki aşamalı bir prosedürde 1.0 μg saflaştırılmış toplam RNA’dan cDNA’yı sentezlemek için ters transkriptaz, poli (A) polimeraz ve oligo dT primerlerini kullanır. İlk olarak, aşağıdakileri hazırlayın: bir vorteks karıştırıcı, bir termal döngüleyici, 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri, sekiz kuyucuklu şerit tüpler, her sekiz şeritli tüpün kapağı, damıtılmış su, buz ve bir ters transkriptaz kiti (bkz. Termal döngüleyiciyi başlatın. Ana karışım çözeltisini hazırlayın; tüp başına toplam 8.0 μL ana karışım çözeltisi elde etmek için, kitte bulunan ters transkriptaz karışımının 2.0 μL’sini ve ters transkripsiyon tamponunun 4.0 μL’sine 2.0 μL 10x nükleik asit karışımı ekleyin. Sekiz delikli bir şerit tüpün her bir tüpüne 8,0 μL ana karışım çözeltisi ekleyin. Toplam RNA yoğunluğunu aşağıdaki gibi ayarlayın. 1.0 μg toplam RNA’nın 12 μL RNaz içermeyen su ile bir böbrek örneğinden ayrılması için, uygun miktarda toplam RNA alın ve yukarıda tarif edildiği gibi ölçülen konsantrasyonu kullanarak damıtılmış suya aktarın (Adım 4.15’te).NOT: DNA kontaminasyonu varlığında, kontamine DNA qRT-PCR ile birlikte güçlendirilir. Yukarıda Adım 5.5.-5.8’de açıklananlarla aynı işlemi gerçekleştirin. 7. miRNA’nın qRT-PCR’si NOT: miRNA’ların qRT-PCR’si için bir interkalatör yöntemi kullanılır. Astarlar RNA için kullanılır: U6 küçük nükleer 2 (RNU6-2), miRNA-223-3p, miRNA-423-5p, miRNA-7218-5p ve miRNA-7219-5p. Aşağıdakileri hazırlayın: bir vorteks karıştırıcı, gerçek zamanlı bir PCR sistemi, qRT-PCR için 96 delikli bir reaksiyon plakası, 96 delikli reaksiyon plakası için yapışkan film, yapışkan film aplikatörü, 96 delikli bir santrifüj rotoru, miRNA’ya özgü primerler, 2x PCR ana karışımı ve 10x üniversal astar içeren yeşil boya bazlı bir PCR kiti (bkz. Malzeme Tablosu)13,14, ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü. Vorteks, 1.5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpünde karıştırdıktan sonra aşağıdakileri yapın: 6.25 μL damıtılmış su, nükleaz içermeyen suda çözünmüş 5 μM miRNA astarının her biri 1.25 μL, 12.5 μL 2x PCR ana karışımı ve 2.5 μL 10x üniversal astar. Adım 5 (serum) veya Adım 6’da (böbrek) tanımlandığı gibi sentezlenen cDNA’yı hazırlayın ve eritin. Vorteks ve cDNA’yı 5 s için santrifüj edin. Reaktifin 22.5 μL alikotlarını alın (yukarıdaki Adım 7.2’de açıklandığı gibi) ve bunları 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna ayrı ayrı yerleştirin. Plakanın her bir kuyucuğuna 2.5 μL aliquot cDNA ekleyin. Yapışkan filmi plakaya sabitlemek için, yapışkan film aplikatörünü kullanın. Plakayı 96 delikli santrifüj rotorunda 1.000 x g’de 30 sn santrifüj yapın. Her bir kuyucuğun altındaki reaksiyonu stabilize edin. 8. PCR bisiklet programını çalıştırmak için gerçek zamanlı PCR sistemini ve yazılımını kullanma Gerçek zamanlı PCR sistemine başlayın. Oluşturulan plakayı Adım 7.6’da açıklandığı gibi yerleştirin. gerçek zamanlı PCR sisteminde. Ayarları değiştirin; deneme için bir ad sağlayın ve ardından sistemin deneme türü olarak 96 kuyucuklu (0,2 mL ), niceleme yöntemi olarak Karşılaştırmalı CT (ΔΔCT), sistem çalıştırma modu olarak standart ve hedef sırayı algılamak için reaktifler olarak SYBR Yeşil Reaktifleri’ni seçin. Numune ve hedef miRNA’lar için isimler sağlayın ve her bir kuyucuktaki numuneyi ve hedef miRNA’yı adlandırın. Sonuçları doğrulamak için uygun veriler elde etmek için yinelenen numuneler atayın ve bir referans numune ve endojen kontrol seçin. Boyanın pasif başvuru olarak kullanılması için hiçbiri’ni seçin. Reaktif çapraz kontaminasyonunu ortadan kaldırmak için, negatif ters transkriptaz ve miRNA ekspresyonu için şablon olmayan bir kontrol ayarlayın. Daha sonra, reaksiyon hacminin 20 μL’ye ayarlandığından ve PCR döngü koşullarının aşağıdaki gibi ayarlandığından emin olun: 15 dakika boyunca 95 ° C, daha sonra 15 s için 94 ° C’de 40 döngü denatürasyon, 30 s için 55 ° C’de tavlama ve son olarak 30 s için 70 ° C’de uzatma. İşlem tamamlandıktan sonra qRT-PCR verilerini analiz etmek için sistemin yazılım programında analiz et’e tıklayın. Program tarafından otomatik olarak seçilen eşik çizgisinin her kuyu için uygun olduğunu onaylayın. Endojen kontrolün eşik döngüsü (BT) değerini kontrol edin ve her numunede analiz edilen hedef miRNA’ları kontrol edin. CT değerlerini, amplifikasyon eğrisinin ve eşik çizgisinin kesişimine göre belirleyin.NOT: Bu çalışmada, hedef miRNA ekspresyon düzeyleri için endojen kontroller olarak RNU6-2 ve miRNA-423-5p kullanılmış ve her bir hedef miRNA18’in bağıl ekspresyon düzeylerini belirlemek için ΔΔCT yöntemi kullanılmıştır.