JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

التقييم الكمي لتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي لتعبير الحمض النووي الريبي الميكروي في الكلى ومصل الفئران المصابة باختلال كلوي معتمد على العمر

Published: April 29, 2022
doi:
10.3791/63258
, , , , ,
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center,Jichi Medical University, 2Division of Intensive Care Unit, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center,Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology,Meiji Pharmaceutical University

Summary

نقدم طريقة لتقييم تعبير microRNA في الكلى والمصل للفئران التي تعاني من اختلال كلوي يعتمد على العمر عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) هي RNAs صغيرة غير مشفرة تتكون من 21-25 قاعدة. فهي لا تترجم إلى بروتينات بل تعمل على إعاقة عمل الحمض النووي الريبي الرسول المستهدف (mRNAs) عن طريق زعزعة استقرارها وتعطيل ترجمتها. على الرغم من أنه تم التحقيق في ملامح تعبير miRNA في مختلف أعضاء وأنسجة الفئران ، إلا أنه لم تكن هناك طرق قياسية لتنقية وقياس كمية الكلى الفأرية و miRNAs في المصل. لقد أنشأنا طريقة فعالة وموثوقة لاستخراج وتقييم تعبير miRNA في مصل وكلية الفئران المصابة باختلال كلوي يعتمد على العمر.

وتستخدم هذه الطريقة التفاعل المتسلسل الكمي للنسخ العكسي والبوليميراز (qRT-PCR)، ويتطلب البروتوكول ست خطوات: (1) إعداد الفئران المقاومة للفئران المسرعة للشيخوخة 1 (SAMR1) والفئران المعرضة للشيخوخة المتسارعة (SAMP1)؛ (2) إعداد الفئران المعرضة للشيخوخة المسرعة للشيخوخة (SAMP1)؛ (2) إعداد الفئران المعرضة للشيخوخة (SAMP1) والفئران المعرضة للشيخوخة (SAMP1)؛ (2) إعداد الفئران المعرضة للشيخوخة (SAMP1) والفئران المعرضة للشيخوخة (SAMP1)؛ (2) إعداد الفئران المعرضة للشيخوخة (SAMP1) والفئران المعرضة للشيخوخة ( (2) استخراج عينات المصل من هذه الفئران. (3) استخراج عينة من الكلى من كل فأر ؛ (4) استخراج الحمض النووي الريبي الكلي (بما في ذلك miRNA) من عينات الكلى والمصل من كل فأر ؛ (5) تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) مع النسخ العكسي من miRNA ؛ (6) إجراء qRT-PCR باستخدام cDNA الذي تم الحصول عليه.

تم استخدام هذا البروتوكول لتأكيد أنه ، مقارنة بالضوابط ، تم تغيير التعبير عن miRNA-7218-5p و miRNA-7219-5p بشكل كبير في الكلى والمصل لنموذج الفأر من القصور الكلوي المعتمد على العمر. أوضح هذا البروتوكول أيضا العلاقة بين الكلى والمصل لنموذج الفأر للاختلال الكلوي المعتمد على العمر. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد تعبير miRNA في الكلى ومصل الفئران المصابة باختلال كلوي يعتمد على العمر.

Introduction

من المعروف أن التعبير عن مختلف الحمض النووي الريبوزي المرسال الذي يلعب أدوارا مهمة في كل من علم وظائف الأعضاء والمرض (على سبيل المثال ، الالتهاب والتليف والاضطرابات الأيضية والسرطان) يتم تنظيمه بواسطة miRNAs ، وهي RNAs قصيرة وغير مشفرة تسبب التدهور وتمنع نسخ mRNA1. لذلك ، من الممكن أن تكون بعض miRNAs بمثابة مؤشرات حيوية مرشحة جديدة و / أو أهداف علاجية لمختلف الأمراض2،3،4،5. تم إجراء الأبحاث على ملامح تعبير miRNA في مجموعة متنوعة من أعضاء وأنسجة الفئران (بما في ذلك الدماغ6 والقلب7 والرئة8 والكبد9 والكلى10). ومع ذلك ، لا توجد طرق قياسية أو ثابتة لاستخراج وتقييم miRNAs في الكلى أو مصل الفئران المصابة باختلال كلوي يعتمد على العمر.

لذلك ، أنشأنا بروتوكولا يمكن استخدامه لتنقية واكتشاف تعبير miRNA بشكل موثوق في مصل وكلية الفئران المصابة باختلال كلوي يعتمد على العمر. وهناك ست خطوات رئيسية في البروتوكول: (1) إعداد كل من الفئران الذكور SAMR1 البالغة من العمر 50 أسبوعا والفئران الذكور SAMP1؛ (2) إعداد كل من الفئران الذكور SAMR1 البالغة من العمر 50 أسبوعا والفئران الذكور SAMP1؛ (2) إعداد كل من الفئران الذكور SAMR1 البالغة من العمر 50 أسبوعا والفئران الذكور SAMP1؛ (2) إعداد كل من الفئران الذكور SAMR (2) استخراج عينات الدم من الوريد الأجوف السفلي لكلتا السلالتين من الفئران ، مع الاستخدام اللاحق لأنبوب سبيتز مع الهيبارين ، يليه الطرد المركزي ، للحصول على عينة مصل ؛ (3) استخراج عينة الكلى من الفئران – يتم استخدام مجانس السيليكون لتجانس عينة الكلى بشكل منفصل ، ثم يتم نقل العينة إلى نظام تمزيق البوليمر الحيوي على عمود دوران جهاز الطرد المركزي الدقيق11 ؛ (4) إجمالي استخراج الحمض النووي الريبي (الذي يحتوي على miRNA) من عينات المصل باستخدام عمود الدوران القائم على غشاء السيليكا12 وإجمالي الحمض النووي الريبي الذي يحتوي على استخراج miRNA من عينات الكلى باستخدام عمود الدوران القائم على غشاء السيليكا11 ؛ (5) تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام النسخ العكسي ، بوليميراز البولي (A) ، وأوليغو-دي تي التمهيدي13،14 ؛ و (6) أخيرا ، تحديد تعبير miRNA باستخدام qRT-PCR وصبغة متداخلة13,14.

استند هذا البروتوكول الجديد إلى دراسات نجحت في استخراج وتقييم الحمض النووي الريبوزي المرسال في أنواع مختلفة من الأنسجة11،12،13. وقد ثبت أن نظام تمزيق البوليمر الحيوي في البروتوكول قادر على تنقية الحمض النووي الريبي الكلي عالي الجودة من الأنسجة11. تم تحديد دقة وحساسية جوانب هذا البروتوكول المستخدم لتقييم تعبير miRNA بواسطة qRT-PCR مع صبغة متداخلة13,14 ، على سبيل المثال ، تخليق cDNA مع النسخ العكسي ، بوليميراز بولي (A) ، وأوليغو-dT الاشعال من الحمض النووي الريبي الكلي المستخلص. يتمتع البروتوكول الجديد بالعديد من المزايا: البساطة وتوفير الوقت وتقليل الأخطاء الفنية. وبالتالي ، يمكن استخدامه للتحقيقات التي تتطلب تحديد دقيق وحساس لملامح الكلى والدم miRNA. يمكن لدراسات العديد من الحالات المرضية أيضا استخدام البروتوكول الجديد.

يمكن تحديد ملامح تعبير miRNA في فئران SAMP1 ، والتي تعد نموذجا للاختلال الكلوي المعتمد على العمر ، كما هو موضح أدناه. في البشر ، يرتبط القصور الكلوي المعتمد على العمر بتطور الفشل الكلوي ويتميز بزيادة في مساحة التليف الخلالي الكلوي وتطور تصلب الكبيبات15,16. القصور الكلوي المعتمد على العمر هو أيضا سمة مهمة ومتكررة لأمراض الكلى المزمنة وأمراض الكلى في المرحلة النهائية15,16.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة جيتشي الطبية وتم تنفيذه وفقا لدليل جامعة جيتشي الطبية لحيوانات المختبر ومبادئها التوجيهية المتعلقة باستخدام التجارب ورعايتها. يستخدم هذا البروتوكول أربعة فئران ذكور SAMR1 عمرها 50 أسبوعا وفئران ذكور SAMP1 (40-45 جم). 1. جمع عينات المصل قم بإعداد ما يلي لكل ماوس: إبر 30 جم مع حقنة 1.0 مل ، أنبوب طرد مركزي سبيتز سعة 1.0 مل مع الهيبارين ، أنابيب طرد مركزي دقيقة 1.5 مل ، مخدر أيسوفلوران ، ورقة فلين ، إيثانول 70٪ ، مسحتان قطنيتان مبللتان بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، طبق بتري مع PBS ، ملاقط ، ومقص جراحي. تخدير الفأر مع 1.5 ٪ isoflurane والحفاظ على 1.5 ٪. إدارة مسكن (ميلوكسيكام 5 ملغ / كغ) تحت الجلد ، ثم حقن 1.0 مل من الإيثانول 70 ٪ في بطنه ووضعه في وضع ضعيف على ورقة الفلين. تأكد من عمق التخدير عن طريق اختفاء منعكس سحب الدواسة. مع الملقط والمقص الجراحي ، شق جلد البطن. قطع العضلات والغشاء البريتوني من المثانة إلى الحافة السفلية اليسرى من الأضلاع. استخدم الملقط لرفع الغشاء البريتوني ، وقم بعمل شق جانبي في الحافة العليا للغشاء البريتوني باستخدام المقص الجراحي. استمر في الشق على طول الحافة السفلية للأضلاع. حدد الوريد الأجوف السفلي باستخدام مسحتي القطن المبللتين بواسطة PBS. أدخل إحدى إبر 30 جم مع حقنة 1.0 مل في الوريد الأجوف السفلي ثم اسحب المحقنة. اسحب الإبرة من الوريد الأجوف السفلي ببطء لتجنب انحلال الدم. انقل الدم إلى أنبوب سبيتز سعة 1.0 مل مع الهيبارين ثم اخلطه عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات.ملاحظة: يتم قتل الفأر الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم. قم بتدوير أنبوب سبيتز في درجة حرارة الغرفة (RT) ، 3000 × جم لمدة 10 دقائق. قم بشفط المادة الفائقة ببطء ، وتأكد من أنها لا تحتوي على رواسب ، ثم انقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق غير مستخدم سعة 1.5 مل. يخزن الأنبوب عند -80 درجة مئوية قبل الاستخدام.ملاحظة: في حالة المتابعة إلى الخطوة 3 على الفور، لا يلزم تخزين الأنبوب عند -80 درجة مئوية. 2. جمع عينات الكلى قم بإعداد ما يلي لكل ماوس: أنابيب تبريد سعة 2.0 مل ، مخدر أيسوفلوران ، ورقة فلين ، إيثانول 70٪ ، طبق بتري مع PBS ، ملاقط ، ومقص جراحي. تخدير الفأر مع 1.5 ٪ isoflurane والحفاظ على 1.5 ٪. إدارة مسكن (ميلوكسيكام 5 ملغ / كغ) تحت الجلد ، ثم حقن 1.0 مل من الإيثانول 70 ٪ في بطنه ، ووضعه في وضع ضعيف على ورقة الفلين. تأكد من عمق التخدير عن طريق اختفاء منعكس سحب الدواسة. استخدم الملقط والمقص الجراحي لإجراء شق في جلد البطن. قطع العضلات والغشاء البريتوني من المثانة إلى الحافة السفلية اليسرى من الأضلاع. استخدم الملقط لرفع الغشاء البريتوني وإجراء شق جانبي في الحافة العلوية للغشاء البريتوني باستخدام المقص الجراحي. استمر في الشق على طول الحافة السفلية للأضلاع. تحديد الكلى اليسرى. ارتجعه مع PBS لطرد الدم من الأوعية حتى تتحول الكلى إلى لون أبيض مصفر. استئصال الكلى بأكملها أولا باستخدام مقص جراحي لقطع الشريان الكلوي الأيسر والوريد. ضع الكلى في طبق بتري واغسلها بعناية باستخدام PBS.ملاحظة: يتم قتل الفأر الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم. استخدم الملقط والمقص الجراحي لقطع الكلى إلى عينات 10 ملغ (10 ملغ هو حجم عينة مناسب للخطوة التالية). ضع كل عينة من الكلى في أنبوب التبريد الخاص بها 2.0 مل. أغلق غطاء الأنبوب. للتخزين على المدى الطويل ، انقل كل أنبوب تبريد إلى النيتروجين السائل وخزنه عند -80 درجة مئوية. 3. إجمالي استخراج الحمض النووي الريبي من عينة المصل قم بإعداد العناصر التالية أولا: خلاط دوامة ، كاشف تحلل قائم على الفينول / جوانيدين ، إيثانول 80٪ ، إيثانول 100٪ ، كلوروفورم 100٪ ، أعمدة دوران البوليمر الحيوي (في أنابيب جمع 2.0 مل 11) ، أعمدة دوران مثبتة بغشاء (في أنابيب تجميع 2.0 مل11) ، مخزن مؤقت للغسيل # 1 (أي مخزن مؤقت للغسيل يحتوي على جوانيدين و100٪ إيثانول بنسبة 1: 2) ، مخزن مؤقت للغسيل # 2 (أي ، غسل المخزن المؤقت الذي يحتوي على جوانيدين والإيثانول 100٪ بنسبة 1: 4) ، والمياه الخالية من RNase ، وأنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل ، وأنابيب الطرد المركزي الدقيقة 2.0 مل. أولا ، خذ عينة مصل 200 ميكرولتر في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل ، ثم أضف 1000 ميكرولتر من كاشف التحلل القائم على الفينول / جوانيدين. دوامة الخليط لمدة 5 ثوان. احتضان العينة في RT لمدة 5 دقائق. أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى عينة المصل في الأنبوب وأغلق غطاء الأنبوب بإحكام. اقلب الأنبوب 15x لخلط الكلوروفورم وعينة المصل. يتم احتضان كل عينة في RT لمدة 3 دقائق. بعد ذلك ، قم بتدوير العينة عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة عند 12000 × جم. انقل 300 ميكرولتر من supernatant إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل دون إزعاج الكرية. أضف 450 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ ، ودوامة الأنبوب لمدة 5 ثوان.ملاحظة: في جميع الخطوات التالية، ضع عمود الدوران المثبتة بالغشاء لفصل الحمض النووي الريبي والحمض النووي في أنبوب تجميع 2.0 مل لطرده مركزيا. ثم ، قم بإزالة 700 ميكرولتر من العينة ، وقم بتحميلها على عمود دوران مثبت بالغشاء ، وأغلق الغطاء. قم بتدوير العمود في RT لمدة 15 ثانية عند 8000 × جم ، واترك السوبرناتان في العمود. تخلص من الكريات المتبقية في أنبوب التجميع. أضف 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل رقم 1 وهو جزء من مجموعة المصل / البلازما (انظر جدول المواد) إلى عمود الدوران المرتبط بالغشاء لتنظيف العينة جيدا. أغلق غطاء العمود وقم بتدوير العمود في RT لمدة 15 ثانية عند 8000 × g ، واترك supernatant في العمود. تخلص من الكريات المتبقية في أنبوب التجميع. لإزالة الأملاح النزرة ، خذ 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل # 2 وقم بتحميله على عمود دوران مثبت بالغشاء. بعد إغلاق غطاء العمود، قم بتدوير العمود في RT لمدة 15 ثانية عند 8000 × جم، واترك الفائق في العمود. تخلص من الكريات في أنبوب التجميع. لإزالة الأملاح النزرة ، خذ 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ وقم بتحميله على عمود دوران مثبت بالغشاء. بعد إغلاق غطاء العمود ، قم بتدوير العمود في RT لمدة 15 ثانية عند 8000 × g ، واترك supernatant في العمود. تخلص من الكريات في أنبوب التجميع. قم بتدوير عمود الدوران المثبت بالغشاء مرة أخرى في RT لمدة 5 دقائق عند 15000 × جم. بعد نقل عمود الدوران المثبتة بالغشاء إلى أنبوب تجميع جديد 1.5 مل ، أضف 14 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase إلى العمود لإذابة الحمض النووي الريبي الكلي. بعد إغلاق غطاء العمود ، انتظر 5 دقائق مع ترك الأنبوب في RT. قم بتدوير العمود مرة أخرى لمدة 1 دقيقة عند 15000 × g في RT. قم بتخزين الأنابيب مع العينات عند -80 درجة مئوية قبل الاستخدام. 4. استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من عينة الكلى قم بإعداد العناصر التالية أولا: مجانس السيليكون ، الثلج ، خلاط دوامة ، الإيثانول 100٪ ، الكلوروفورم 100٪ ، أعمدة دوران البوليمر الحيوي (في أنابيب جمع 2.0 مل11) ، أعمدة الدوران المثبتة بالأغشية (في أنابيب جمع 2.0 مل11) ، كاشف التحلل القائم على الفينول / جوانيدين ، المخزن المؤقت للغسيل # 1 (نفس المخزن المؤقت مثل الخطوة 3.1.) ، المخزن المؤقت للغسيل # 2 (نفس المخزن المؤقت مثل الخطوة 3.1.) ، مياه خالية من RNase ، وأنابيب أجهزة طرد مركزي دقيقة 1.5 مل ، وأنابيب أجهزة طرد مركزي دقيقة سعة 2.0 مل. ضع عينة من الكلى 10 ملغ في مجانس السيليكون ، وأضف 700 ميكرولتر من كاشف التحلل القائم على الفينول / جوانيدين. قم بإعداد المجانس. اضغط بلطف ولف مدقة المجانس ضد عينة الكلى لتجانس العينة. استمر في الضغط على المدقة ولفها حتى يتم تجانس عينة الكلى تماما في كاشف التحلل القائم على الفينول / الجوانيدين. لمزيد من التجانس ، خذ الليزات المتجانسة (في أنبوب جمع 2.0 مل) وانقلها إلى عمود دوران البوليمر الحيوي. قم بطرد مركزي للليزات المتجانسة في RT لمدة 3 دقائق عند 14000 × جم ثم انقل الكريات المترسبة بالكامل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق غير مستخدم سعة 1.5 مل لعكس الكريات المترسبة خلط الكريات مع 140 ميكرولتر من الكلوروفورم في الأنبوب. ثم ، أغلق غطاء الأنبوب بإحكام. اقلب الأنبوب 15x لخلط الليزات والكلوروفورم.ملاحظة: يمكن استخدام الكلوروفورم بأمان بدون غطاء محرك السيارة. احتضان العينة في RT لمدة 2-3 دقائق. الطرد المركزي للعينة عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة عند 12000 × جم. انقل السوبرناتانت (الذي عادة ما يكون ~ 300 ميكرولتر) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد 1.5 مل ، دون إزعاج الراسب. أضف 1.5 ضعف حجمه (الذي عادة ما يكون ~ 450 ميكرولتر) من الإيثانول بنسبة 100٪. دوامة الخليط لمدة 5 ثوان.ملاحظة: في جميع الخطوات التالية، ضع عمود الدوران المثبت بالغشاء لفصل الحمض النووي الريبي والحمض النووي في أنبوب تجميع سعة 2.0 مل لطرده مركزيا. قم بتحميل 700 ميكرولتر من العينة على أحد أعمدة الدوران المثبتة بالغشاء. أغلق الغطاء وقم بالطرد المركزي للعمود عند 15000 × جم لمدة 15 ثانية. تخلص من الليزات المترسبة المتبقية في أنبوب التجميع. أضف 700 ميكرولتر من مخزن الغسيل العازل رقم 1 إلى عمود الدوران لغسله جيدا. أغلق الغطاء وقم بالطرد المركزي للعمود عند 15000 × جم لمدة 15 ثانية. تخلص من الليزات المترسبة المتبقية في أنبوب التجميع. لإزالة كميات ضئيلة من الملح ، قم بتحميل 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل # 2 على عمود الدوران المثبت بالغشاء. بعد إغلاق غطاء العمود ، قم بالطرد المركزي للعمود عند 15000 × جم لمدة 15 ثانية. تخلص من الليزات المترسبة في أنبوب التجميع. كرر الخطوة 4.11. قم بالطرد المركزي لعمود الدوران المثبت بالغشاء مرة أخرى لمدة دقيقة واحدة عند 15000 × جم. تخلص من الليزات المترسبة في أنبوب التجميع. خذ عمود الدوران المثبت بالغشاء وانقله إلى أنبوب تجميع جديد سعة 1.5 مل. أضف 30 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase إلى العمود لإذابة الحمض النووي الريبي الكلي. بعد إغلاق غطاء العمود ، انتظر لمدة 5 دقائق مع الأنبوب في RT ، ثم قم بالطرد المركزي للعمود لمدة دقيقة واحدة عند 15000 × جم. انقل الحجم الكلي للعينة التي تحتوي على الحمض النووي الريبي الكلي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. ضع الأنبوب على الجليد ، وقم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي الكلي عن طريق القياس الطيفي. تأكد من أن إجمالي تركيز الحمض النووي الريبي هو ~ 300-1500 نانوغرام / ميكرولتر. تخزين الأنابيب التي تحتوي على عينات في -80 درجة مئوية قبل الاستخدام. 5. تخليق cDNA مع النسخ العكسي للحمض النووي الريبي الكلي في المصل ملاحظة: توصي المبادئ التوجيهية للحد الأدنى من المعلومات لنشر تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمية في الوقت الفعلي (MIQE) باستخدام ممارسات تجريبية أفضل للحصول على نتائج موثوقة لا لبس فيها17. في هذا البروتوكول ، يتم تصنيع cDNA من إجمالي الحمض النووي الريبي الذي تم تنقيته في إجراء من خطوتين باستخدام النسخ العكسي ، بوليميراز بولي (A) ، والاشعال oligo-dT. قم بإعداد ما يلي أولا: خلاط دوامة ، ودورة حرارية ، وأنابيب شريط ثمانية آبار ، وغطاء كل أنبوب من ثمانية شرائح ، وماء مقطر ، وثلج ، ومجموعة النسخ العكسي (انظر جدول المواد) 13،14 في الحالة الذائبة ، وأنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل. بدء تشغيل الدراجة الحرارية. تحضير حل المزيج الرئيسي ؛ للحصول على ما مجموعه 8.0 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لكل أنبوب شريط من ثمانية آبار ، أضف 2.0 ميكرولتر من مزيج النسخ العكسي (المضمن في المجموعة) و 2.0 ميكرولتر من مزيج الأحماض النووية 10x إلى 4.0 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنسخ العكسي في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل. ضع 8.0 ميكرولتر من محلول المزيج الرئيسي في كل أنبوب من أنبوب شريط من ثمانية آبار. ضع أليكوت 12 ميكرولتر من إجمالي الحمض النووي الريبي في كل أنبوب من أنبوب الشريط المكون من ثمانية آبار، وأغلق غطاء الأنبوب. جهاز طرد مركزي للأنبوب لمدة 15 ثانية في RT و 2000 × جم. ضع الأنبوب في الدوار الحراري واحتضنه لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. احتضن العينة لمدة 5 دقائق إضافية عند 95 درجة مئوية دقيقة لتوليف cDNA. بعد الحضانة ، انقل cDNA إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل. تمييع cDNA عشرة أضعاف (1:10) بالماء المقطر. دوامة والطرد المركزي أنبوب لمدة 5 ثانية في RT و 2000 × غرام. تخزين cDNA المخفف مؤقتا على الجليد. تخزين العينات المخففة في -80 درجة مئوية قبل الاستخدام. 6. تخليق cDNA مع النسخ العكسي للحمض النووي الريبي الكلي في الكلى ملاحظة: تشجع المبادئ التوجيهية MIQE على ممارسات تجريبية أفضل لضمان نتائج موثوقة لا لبس فيها17. يستخدم هذا البروتوكول النسخ العكسي والبوليميراز البوليميراز (A) والأوليغو dT الاشعال لتوليف cDNA من 1.0 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي الكلي المنقى في إجراء من خطوتين. أولا ، قم بإعداد ما يلي: خلاط دوامة ، ودورة حرارية ، وأنابيب طرد مركزي دقيق 1.5 مل ، وأنابيب شريط ثمانية آبار ، وغطاء كل أنبوب من ثمانية شرائح ، والماء المقطر ، والجليد ، ومجموعة النسخ العكسي (انظر جدول المواد) 13,14 في الحالة المنصهرة. بدء تشغيل الدراجة الحرارية. تحضير حل المزيج الرئيسي ؛ للحصول على ما مجموعه 8.0 ميكرولتر من محلول المزيج الرئيسي لكل أنبوب، أضف 2.0 ميكرولتر من مزيج النسخ العكسي المضمن في المجموعة و 2.0 ميكرولتر من مزيج الأحماض النووية 10x إلى 4.0 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنسخ العكسي. أضف 8.0 ميكرولتر من محلول المزيج الرئيسي إلى كل أنبوب من أنبوب شريط من ثمانية آبار. اضبط كثافة الحمض النووي الريبي الكلية على النحو التالي. لفصل 1.0 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي من عينة الكلى مع 12 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase ، خذ كمية مناسبة من إجمالي الحمض النووي الريبي وانقله إلى الماء المقطر باستخدام التركيز المقاس كما هو موضح أعلاه (في الخطوة 4.15).ملاحظة: في حالة وجود تلوث الحمض النووي ، يتم تضخيم الحمض النووي الملوث بواسطة qRT-PCR. قم بتنفيذ نفس العملية الموضحة أعلاه في الخطوات من 5.5.إلى 5.8. 7. qRT-PCR من miRNA ملاحظة: يتم استخدام طريقة intercalator ل qRT-PCR من miRNAs. تستخدم الاشعال للحمض النووي الريبي: U6 النووي الصغير 2 (RNU6-2) ، miRNA-223-3p ، miRNA-423-5p ، miRNA-7218-5p ، و miRNA-7219-5p. قم بإعداد ما يلي: خلاط دوامة ، نظام PCR في الوقت الفعلي ، لوحة تفاعل 96 بئرا ل qRT-PCR ، فيلم لاصق للوحة تفاعل 96 بئرا ، قضيب فيلم لاصق ، دوار طرد مركزي 96 بئر ، برايمر خاص ب miRNA ، مجموعة PCR قائمة على الصبغة الخضراء تحتوي على مزيج رئيسي 2x PCR و 10x تمهيدي عالمي (انظر جدول المواد) 13,14 ، وأنبوب جهاز طرد مركزي دقيق 1.5 مل. دوامة ما يلي بعد خلطها في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل: 6.25 ميكرولتر من الماء المقطر ، 1.25 ميكرولتر لكل من 5 ميكرومتر miRNA التمهيدي المذاب في الماء الخالي من النوكليز ، 12.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي PCR 2x ، و 2.5 ميكرولتر من 10x التمهيدي العالمي. تحضير وإذابة cDNA توليفها كما هو موضح في الخطوة 5 (المصل) أو الخطوة 6 (الكلى). دوامة والطرد المركزي cDNA لمدة 5 ثانية. خذ 22.5 ميكرولتر من الكاشف (كما هو موضح في الخطوة 7.2. أعلاه) وضعها بشكل منفصل في كل بئر من لوحة 96 بئرا. أضف أليكوت 2.5 ميكرولتر من cDNA إلى كل بئر من اللوحة. لتأمين الفيلم اللاصق على اللوحة ، استخدم قضيب الفيلم اللاصق. قم بطرد مركزي اللوحة لمدة 30 ثانية عند 1000 × g في دوار أجهزة الطرد المركزي 96 بئرا. استقرار التفاعل في الجزء السفلي من كل بئر. 8. استخدام نظام وبرامج PCR في الوقت الفعلي لتشغيل برنامج ركوب الدراجات PCR ابدأ تشغيل نظام PCR في الوقت الفعلي. ضع اللوحة التي تم إنشاؤها كما هو موضح في الخطوة 7.6. في نظام PCR في الوقت الحقيقي. تعديل الإعدادات; قم بتوفير اسم للتجربة، ثم حدد 96-well (0.2 mL ) كنوع تجربة النظام، وCT المقارن (ΔΔCT) كطريقة الكمية، وقياسي كوضع تشغيل النظام، وكواشف SYBR الخضراء ككواشف للكشف عن التسلسل المستهدف. قدم أسماء للعينة والحمض النووي الريبوزي المرسال المستهدف، وقم بتسمية العينة والحمض النووي الريبوزي المرسال المستهدف في كل بئر. قم بتعيين عينات مكررة للحصول على بيانات مناسبة لتأكيد النتائج، واختر عينة مرجعية وعنصر تحكم داخلي. لكي تستخدم الصبغة كمرجع سلبي، حدد لا شيء. للقضاء على التلوث المتبادل للكاشف، قم بإعداد النسخ العكسي السلبي وعنصر تحكم غير قالب لتعبير miRNA. بعد ذلك ، تأكد من ضبط حجم التفاعل على 20 ميكرولتر وتعيين شروط دورة PCR على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم 40 دورة من تمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، والتلدين عند 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، وأخيرا التمديد عند 70 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. انقر فوق تحليل في برنامج النظام لتحليل بيانات qRT-PCR بعد اكتمال العملية. تأكد من أن خط العتبة الذي يحدده البرنامج تلقائيا مناسب لكل بئر. تحقق من قيمة دورة العتبة (CT) للتحكم الداخلي واستهداف miRNAs التي تم تحليلها في كل عينة. أوجد قيم التصوير المقطعي المحوسب عن طريق تقاطع منحنى التضخيم وخط العتبة.ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام RNU6-2 و miRNA-423-5p كضوابط داخلية المنشأ لمستويات تعبير miRNA المستهدفة، وتم استخدام طريقة ΔΔCT لتحديد مستويات التعبير النسبية لكل هدف miRNA18.

Representative Results

بالنسبة لنموذج فأر القصور الكلوي المعتمد على العمر ، استخدمنا الفئران الذكور SAMP1 البالغة من العمر 50 أسبوعا والتي تزن 40-45 جم. تم جمع ما يقرب من 0.8 مل من الدم لكل فأر ونقلها إلى أنبوب سبيتز سعة 1.0 مل مع الهيبارين والمقلوب والطرد المركزي. تم شطف كل كلية باستخدام PBS ، وتشريحها ، وتخزينها في النيتروجين السائل لمزيد من التحليل. كانت الفئران SAMR1 البالغة من العمر خمسين أسبوعا بمثابة عناصر تحكم. استنادا إلى بيانات miRNA qRT-PCR التي تم الحصول عليها باستخدام نموذج القصور الكلوي المعتمد على العمر ، لاحظنا أن مستوى الكلى من miRNA-7219-5p قد زاد بشكل كبير وانخفض مستوى الكلى من miRNA-7218-5p بشكل كبير في الفئران SAMP1 مقارنة بالضوابط (الشكل 1). زادت مستويات المصل لكل من miRNA-7219-5p و miRNA-7218-5p بشكل كبير في فئران SAMP1 مقارنة بالضوابط (الشكل 2). لم تتغير مستويات التعبير عن miRNA-223-3p في أي من السلالتين وبين الكلى والمصل (الشكل 1 والشكل 2). الشكل 1: الحمض النووي الريبي الميكروي المعبر عنه بشكل تفاضلي في كليتي الفئران SAMP1. تحليل qRT-PCR للتعبير عن miRNA-223-3p و miRNA-7218-5p و miRNA-7219-5p في فئران SAMR1 (التحكم ، n = 4) والفئران SAMP1 (n = 4). البيانات متوسطة ± خطأ قياسي (أشرطة الخطأ) ؛ تم استخدام اختبارات t لتحليل الاختلافات بين المجموعات. p < 0.05 اعتبرت معنوية (* p < 0.05) ، n.s.: ليست مهمة. الاختصارات: miRNA = microRNA; SAMP1 = الفأر المتسارع الشيخوخة عرضة ؛ SAMR1 = مقاومة الماوس المتسارعة للشيخوخة 1 ؛ qRT-PCR = تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي النسخ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: الحمض النووي الريبوزي المرسال المعبر عنه بشكل تفاضلي في مصل فئران SAMP1. تحليل qRT-PCR للتعبير عن miRNA-223-3p و miRNA-7218-5p و miRNA-7219-5p في فئران SAMR1 (التحكم ، n = 4) وفئران SAMP1 (n = 4). البيانات متوسطة ± SE (أشرطة الخطأ) ؛ تم استخدام اختبارات t للتحقيق في الاختلافات الكبيرة بين المجموعات. * p < 0.05 بواسطة t-test. الاختصارات: miRNA = microRNA; SAMP1 = الفأر المتسارع الشيخوخة عرضة ؛ SAMR1 = مقاومة الماوس المتسارعة للشيخوخة 1 ؛ qRT-PCR = تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي النسخ العكسي يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تم تحديد مستويات التعبير عن miRNAs المستهدفة بنجاح بواسطة البروتوكول الموصوف أعلاه باستخدام qRT-PCR. يعد تقييم الحمض النووي الريبوزي المرسال المستخرج خطوة مهمة في الحصول على بيانات qRT-PCR ذات مغزى. لتأكيد الجودة الكافية للحمض النووي الريبوزي المرسال قبل إجراء qRT-PCR ، يجب استخدام قياس الطيف الضوئي لتحديد نسبة الامتصاص عند 260 نانومتر إلى تلك الموجودة عند 280 نانومتر. قد يحدث تلوث الحمض النووي ، و / أو قد تكون dimers التمهيدي في كل بئر من لوحة التفاعل موجودة إذا لم يوفر qRT-PCR تضخيما واحدا ل PCR للطول المتوقع ودرجة حرارة الانصهار ، أو إذا كان يوفر منحنى ذوبان أحادي الوسائط.

يمكن تقييم مستويات تعبير MiRNA بعدة طرق أخرى غير qRT-PCR ، بما في ذلك النشاف الشمالي ، والمصفوفة الدقيقة ، وفحوصات حماية الريبونوكلياز. ومع ذلك ، فإن طريقة qRT-PCR هي إجراء حساس ودقيق وبسيط وقابل للتكرار يتطلب حجم عينة أصغر من تلك المطلوبة لفحوصات حماية النشاف الشمالي والريبونوكلياز19. نظرا لأن المصفوفات الدقيقة يمكنها قياس تعبير عشرات الآلاف من miRNAs في وقت واحد ، فيمكن استخدامها لتحديد علامات miRNA المرشحة. تظهر بيانات Microarray أيضا ارتباطا عاما عاليا بالبيانات التي تم الحصول عليها بواسطة qRT-PCR20. ومع ذلك، لم يتم التوصل إلى توافق في الآراء بشأن المنهجية المثلى لمقارنة بيانات المصفوفات الدقيقة التي تم الحصول عليها في دراسات مختلفة21.

يحتوي تقييم miRNAs في المصل على الميزات التالية. أولا ، من السهل جمع المصل ، وبما أن miRNAs في المصل مستقرة ضد التجميد والذوبان ودرجة الحرارة والحمض ، يمكن أن تكون miRNAs مؤشرات حيوية جيدة. ثانيا ، هناك تماثل كبير لل miRNAs بين الأنواع ، ويتم استقراء نتائج التجارب على الحيوانات بسهولة للبشر. ثالثا ، أظهرت miRNAs في المصل إمكانية استخدامها كأدوية علاجية3. وقد أظهرت العديد من الدراسات أيضا أن مستوى التعبير عن miRNA في الأعضاء يرتبط مع miRNA في المصل 22،23،24. في هذه الدراسة ، لم تظهر miRNA-223-3p ، التي لم تظهر مستويات الكلى فيها فرقا كبيرا بين الفئران SAMR1 و SAMP1 ، أي فرق كبير بين السلالة في المصل. في المقابل ، أظهر miRNA-7218-5p و miRNA-7219-5p ، اللذان أظهرت مستويات الكلى بينهما فرقا كبيرا بين الفئران SAMR1 و SAMP1 ، اختلافات كبيرة بين السلالة في المصل.

يحتوي هذا البروتوكول على القيود التالية. أولا ، لم يتم التحقق من فائدته في أعضاء أخرى مثل الكبد والرئة ، وثانيا ، لم يتم اختباره على المختبر الأخرى مثل الفئران والكلاب والخنازير. استخدمت العديد من مجموعات البحث هذا البروتوكول لتنقية واكتشاف الحمض النووي الريبوزي المرسال بواسطة qRT-PCR وأفادت بأن هذا البروتوكول مكن من تنقية الحمض النووي الريبي عالي الجودة من الأنسجة والمصل 13،14،22،23،24. وقد ثبت أن هذه الطريقة لديها دقة وحساسية عالية للكشف عن التعبير عن miRNAs13،14،22،23،24. تظهر نتائج هذه الدراسة أن هذا البروتوكول يمكن أن يكتشف بنجاح تعبير miRNA في مصل وكلية الفئران. لذلك ، يمكن استخدام البروتوكول لتحديد ملامح تعبير miRNA في المصل والكلى في الفئران مع مجموعة متنوعة من الأمراض. نظرا لبساطة البروتوكول ، يمكن معالجة عدد كبير من العينات في وقت واحد. يمكن لتحليلات التعبير عن العديد من miRNAs في مختلف الحالات المرضية للكلية ، وبالتالي ، استخدام البروتوكول الموضح هنا.

هناك جوانب معينة من البروتوكول يجب وضعها في الاعتبار. لتجنب تدهور الحمض النووي الريبوزي المرسال المنقى الذي قد يحدث في درجة حرارة الغرفة، يجب أن تبقى الحمض النووي الريبوزي المرسال على الجليد. يجب تجانس عينات الكلى حتى يتم إذابتها بالكامل في كاشف التحلل. تحتوي كلية الفأر على كمية كبيرة من النسيج الضام غير القابل للذوبان في كاشف التحلل ، وبالتالي يلزم وجود جهاز تمزيق عمود لمزيد من التجانس. بالإضافة إلى ذلك ، يجب التحقق من صحة miRNA التحكم الداخلي المناسب (مع تعبير مستقر بين العينات) طوال إعداد تجربة qRT-PCR. وذلك لأن تداخل المواد المختلفة أثناء أداء هذا البروتوكول يمكن أن يغير مستويات التعبير عن الحمض النووي الريبوزي المرسال (miRNAs) للتحكم الداخلي ، مما قد يعرض النتائج للخطر. في الختام ، تصف هذه الورقة بروتوكول qRT-PCR للكشف عن وتنقية وتقييم تعبير miRNA في مصل وكلية الفئران المصابة باختلال كلوي يعتمد على العمر.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

اي.

Materials

1.0 mL spitz with heparin Greiner-bio-one 450534
Buffer RPE (wash buffer #2 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:4) Qiagen 79216 Wash buffer 2
Buffer RWT (wash buffer #1 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:2) Qiagen 1067933 Wash buffer 1
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR Thermo Fisher Scientific 4316813 96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971 Adhesive film for 96-well reaction plate
miRNA-223-3p primer Qiagen MS00003871 5'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU
G-3'
miRNA-423-5p primer Qiagen MS00012005 5'-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU
UU-3'
miRNA-7218-5p primer Qiagen MS00068067 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG
-3'
miRNA-7219-5p primer Qiagen MS00068081 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA
GA-3'
miRNeasy Mini kit Qiagen 217004 Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube
miRNeasy Serum/Plasma kit Qiagen 217184 Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube
miScript II RT kit (reverse transcription buffer) Qiagen 218161 Reverse transcriptase kit
miScript SYBR Green PCR kit Qiagen 218073 Green dye-based PCR kit
QIA shredder Qiagen 79654 Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube
QIAzol Lysis Reagent (phenol/guanidine-based lysis reagent) Qiagen 79306 Phenol/guanidine-based lysis reagent
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system Thermo Fisher Scientific 4472380 Real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. Thermo Fisher Scientific 4472380 Real-time PCR instrument software
RNase-free water Qiagen 129112
RNU6-2 primer Qiagen MS00033740 Not disclosed due to confidentiality
SAMP1 male mice Nippon SLC Corporation Not assigned
SAMR1 male mice Nippon SLC Corporation Not assigned
Takara biomasher standard Takara Bio 9790B Silicon homogenizer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, Y. The novel regulatory role of lncRNA-miRNA-mRNA axis in cardiovascular diseases. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (12), 5768-5775 (2018).
  2. Yang, C., Dou, R., Yin, T., Ding, J. MiRNA-106b-5p in human cancers: diverse functions and promising biomarker. Biomedicine and Pharmacotherapy. 127, 110211 (2020).
  3. Lu, T. X., Rothenberg, M. E. MicroRNA. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1202-1207 (2018).
  4. McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 145-155 (2015).
  5. Bjorkman, S., Taylor, H. S. MicroRNAs in endometriosis: biological function and emerging biomarker candidates. Biology of Reproduction. 100 (5), 1135-1146 (2019).
  6. Zhou, C. X., et al. miRNA and circRNA expression patterns in mouse brain during toxoplasmosis development. BMC Genomics. 21 (1), 46 (2020).
  7. Jing, R., Zhong, Q. Q., Long, T. Y., Pan, W., Qian, Z. X. Downregulated miRNA-26a-5p induces the apoptosis of endothelial cells in coronary heart disease by inhibiting PI3K/AKT pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 23 (11), 4940-4947 (2019).
  8. Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
  9. Bala, S., et al. Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases. Hepatology. 56 (5), 1946-1957 (2012).
  10. Ishii, H., et al. MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease. Translational Research. 237, 31-52 (2021).
  11. Mastropasqua, R., et al. Serum microRNA levels in diabetes mellitus. Diagnostics (Basel). 11 (2), 284 (2021).
  12. Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. MicroRNA detection in prostate tumors by quantitative real-time PCR (qPCR). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3874 (2012).
  13. Ahn, J. H., Kwak, J., Lee, J. H., Lee, S. S. Efficient and accurate analysis of microRNA using a specific extension sequence. Molecular Biology Reports. 45 (4), 611-619 (2018).
  14. Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. Structural and functional changes With the aging kidney. Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).
  15. Weinstein, J. R., Anderson, S. The aging kidney: physiological changes. Advances in Chronic Kidney Disease. 17 (4), 302-307 (2010).
  16. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  17. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  18. Rajeevan, M. S., Vernon, S. D., Taysavang, N., Unger, E. R. Validation of array-based gene expression profiles by real-time (kinetic) RT-PCR. The Journal of Molecular Diagnostics. 3 (1), 26-31 (2001).
  19. Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
  20. Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR — how well do they correlate. BMC Genomics. 6, 59 (2005).
  21. Petriella, D., et al. miRNA profiling in serum and tissue samples to assess noninvasive biomarkers for NSCLC clinical outcome. Tumour Biology. 37 (4), 5503-5513 (2016).
  22. Skrzypa, M., et al. miRNA-146a-5p is upregulated in serum and cartilage samples of patients with osteoarthritis. Polski Przeglad Chirurgiczny. 91 (3), 1-5 (2019).
  23. Farzanehpour, M., et al. Serum and tissue miRNAs: potential biomarkers for the diagnosis of cervical cancer. Journal of Virology Journal. 16 (1), 116 (2019).

Tags

QRT-PCRMicroRNA ExpressionSerumAge-dependent Renal ImpairmentRNA ExtractionRNA IsolationReal-time PCRGene Expression Profiling

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Yanai, K., Kaneko, S., Ishii, H., Aomatsu, A., Ishibashi, K., Morishita, Y. Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Evaluation of MicroRNA Expression in Kidney and Serum of Mice with Age-Dependent Renal Impairment. J. Vis. Exp. (182), e63258, doi:10.3791/63258 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image