Nous présentons une méthode d’évaluation de l’expression des microARN dans les reins et le sérum de souris atteintes d’insuffisance rénale dépendante de l’âge par réaction en chaîne de la polymérase quantitative à transcription inverse.
Les microARN (miARN) sont de petits ARN non codants composés de 21 à 25 bases. Ils ne sont pas traduits en protéines mais travaillent plutôt à entraver le fonctionnement de leurs ARN messagers cibles (ARNm) en les déstabilisant et en perturbant leur traduction. Bien que les profils d’expression des miARN dans divers organes et tissus de souris aient été étudiés, il n’existe pas de méthodes standard pour purifier et quantifier les miARN rénaux et sériques de souris. Nous avons établi une méthode efficace et fiable pour extraire et évaluer l’expression des miARN dans le sérum et les reins de souris atteintes d’insuffisance rénale dépendante de l’âge.
La méthode utilise la réaction en chaîne quantitative par transcription inverse et polymérase (qRT-PCR), et le protocole nécessite six étapes: (1) préparation de souris à résistance 1 accélérée par sénescence (SAMR1) et de souris sujettes à la sénescence (SAMP1); (2) extraire des échantillons de sérum de ces souris; 3° extraire un échantillon de rein de chaque souris; (4) extraire l’ARN total (y compris les miARN) des échantillons de rein et de sérum de chaque souris; (5) la synthèse de l’ADN complémentaire (ADNc) avec transcription inverse à partir du miARN ; (6) effectuer une qRT-PCR en utilisant l’ADNc obtenu.
Ce protocole a été utilisé pour confirmer que, par rapport aux témoins, l’expression de miRNA-7218-5p et miRNA-7219-5p était significativement modifiée dans les reins et le sérum d’un modèle murin d’insuffisance rénale dépendante de l’âge. Ce protocole a également clarifié la relation entre le rein et le sérum du modèle murin d’insuffisance rénale liée à l’âge. Ce protocole peut être utilisé pour déterminer l’expression des miARN dans les reins et le sérum de souris atteintes d’insuffisance rénale liée à l’âge.
L’expression de divers ARNm qui jouent un rôle important à la fois dans la physiologie et la maladie (par exemple, l’inflammation, la fibrose, les troubles métaboliques et le cancer) est connue pour être régulée par les miARN, qui sont de courts ARN non codants qui causent la dégradation et inhibent la transcription de l’ARNm1. Il est donc possible que certains miARN puissent servir de nouveaux biomarqueurs et/ou cibles thérapeutiques candidats pour diverses maladies 2,3,4,5. Des recherches ont été menées sur les profils d’expression des miARN dans une variété d’organes et de tissus de souris (y compris le cerveau6, le cœur7, le poumon8, le foie9 et le rein10). Cependant, il n’existe pas de méthodes standard ou établies pour extraire et évaluer les miARN dans les reins ou le sérum de souris atteintes d’insuffisance rénale dépendante de l’âge.
Par conséquent, nous avons établi un protocole qui peut être utilisé pour purifier et détecter de manière fiable l’expression des miARN dans le sérum et les reins de souris atteintes d’insuffisance rénale liée à l’âge. Le protocole comporte six étapes principales : (1) préparation des souris mâles SAMR1 âgées de 50 semaines et des souris mâles SAMP1 ; 2) l’extraction d’échantillons de sang de la veine cave inférieure des deux souches de souris, suivie de l’utilisation d’un tube à bec contenant de l’héparine, suivie d’une centrifugation, pour obtenir un échantillon de sérum; (3) l’extraction de l’échantillon de rein de l’homogénéisateur de silicium de souris-A est utilisée pour homogénéiser l’échantillon de rein séparément, et l’échantillon est ensuite transféré dans un système de déchiquetage de biopolymères sur une colonne de spin de microcentrifugeuse11; (4) extraction d’ARN total (contenant des miARN) à partir des échantillons de sérum à l’aide d’une colonnede spin 12 à base de membrane de silice et d’ARN total contenant de l’ARN miARN à partir des échantillons de rein à l’aide d’une colonne de spin11 à base de membrane de silice; (5) synthèse d’ADN complémentaire (ADNc) à partir de l’ARN total à l’aide de la transcriptase inverse, de la poly(A) polymérase et de l’amorce oligo-dT13,14; et (6) enfin, la détermination de l’expression des miARN à l’aide de qRT-PCR et d’un colorant intercalant13,14.
Ce nouveau protocole était basé sur des études qui ont réussi à extraire et à évaluer des miARN dans divers types de tissus11,12,13. Il a été démontré que le système de déchiquetage des biopolymères du protocole était capable de purifier l’ARN total de haute qualité des tissus11. La précision et la sensibilité des aspects de ce protocole utilisés pour l’évaluation de l’expression des miARN par qRT-PCR avec un colorant intercalant ont été établies13,14, par exemple, la synthèse de l’ADNc avec transcriptase inverse, poly(A) polymérase, et oligo-dT amorces à partir de l’ARN total extrait. Le nouveau protocole présente plusieurs avantages : simplicité, gain de temps et réduction des erreurs techniques. Il peut donc être utilisé pour des investigations qui nécessitent une identification précise et sensible des profils de miARN rénaux et sériques. Les études de nombreuses conditions pathologiques peuvent également utiliser le nouveau protocole.
Les profils d’expression des miARN chez les souris SAMP1, qui sont un modèle d’insuffisance rénale dépendante de l’âge, peuvent être déterminés comme indiqué ci-dessous. Chez l’homme, l’insuffisance rénale dépendante de l’âge est associée à la progression de l’insuffisance rénale et se caractérise à la fois par une augmentation de la zone de fibrose interstitielle rénale et par la progression de la glomérulosclérose15,16. L’insuffisance rénale liée à l’âge est également une caractéristique importante et fréquente de l’insuffisance rénale chronique et de l’insuffisance rénale terminale15,16.
Les niveaux d’expression des miARN cibles ont été déterminés avec succès par le protocole décrit ci-dessus en utilisant la qRT-PCR. L’évaluation des miARN extraits est une étape importante dans l’obtention de données qRT-PCR significatives. Pour confirmer la qualité adéquate des miARN avant d’effectuer la qRT-PCR, la spectrophotométrie doit être utilisée pour déterminer le rapport d’absorbance à 260 nm à celui à 280 nm. Une contamination de l’ADN peut se produire et/ou des dimères d’amorce dans chaque puits de la plaque de réaction peuvent être présents si la qRT-PCR ne fournit pas une seule amplification PCR de la longueur et de la température de fusion prévues, ou si elle fournit une courbe de fusion monomodale.
Les niveaux d’expression des miARN peuvent être évalués par plusieurs méthodes autres que la qRT-PCR, y compris le transfert de Northern, un microréseau et des tests de protection contre les ribonucléases. Cependant, la méthode qRT-PCR est une procédure sensible, précise, simple et reproductible qui nécessite un volume d’échantillon inférieur à ceux requis pour les tests de Northern blot et de protection contre la ribonucléase19. Étant donné que les puces à ADN peuvent mesurer l’expression de dizaines de milliers de miARN simultanément, elles peuvent être utilisées pour identifier les marqueurs de miARN candidats. Les données des puces à ADN montrent également une forte corrélation globale avec les données obtenues par qRT-PCR20. Cependant, aucun consensus n’a été atteint quant à la méthodologie optimale pour comparer les données de microréseaux obtenues dans différentes études21.
L’évaluation des miARN sériques présente les caractéristiques suivantes. Tout d’abord, il est facile de recueillir du sérum, et comme les miARN sériques sont stables contre le gel et la décongélation, la température et l’acide, les miARN peuvent être de bons biomarqueurs. Deuxièmement, il existe une forte homologie des miARN entre les espèces, et les résultats des expériences sur les animaux sont facilement extrapolés aux humains. Troisièmement, les miARN sériques ont montré un potentiel d’utilisation en tant que médicaments thérapeutiques3. Plusieurs études ont également démontré que le niveau d’expression des miARN dans les organes est corrélé avec le miARN dans le sérum22,23,24. Dans la présente étude, miRNA-223-3p, dont les taux rénaux n’ont pas montré de différence significative entre les souris SAMR1 et SAMP1, n’a pas non plus montré de différence significative entre les souches dans le sérum. En revanche, miRNA-7218-5p et miRNA-7219-5p, dont les niveaux rénaux ont montré une différence significative entre les souris SAMR1 et SAMP1, ont montré des différences considérables entre les souches dans le sérum.
Ce protocole présente les limitations suivantes. Premièrement, son utilité n’a pas été vérifiée dans d’autres organes tels que le foie et les poumons, et deuxièmement, il n’a pas été testé sur d’autres animaux de laboratoire tels que les rats, les chiens et les porcs. Plusieurs groupes de recherche ont utilisé ce protocole pour la purification et la détection des miARN par qRT-PCR et ont rapporté que ce protocole permettait la purification d’ARN de haute qualité à partir de tissus et de sérum 13,14,22,23,24. Il a été démontré que cette méthode a une précision et une sensibilité élevées pour détecter l’expression des miARN 13,14,22,23,24. Les résultats de la présente étude démontrent que ce protocole peut détecter avec succès l’expression de miARN dans le sérum et les reins de souris. Par conséquent, le protocole peut être utilisé pour déterminer les profils d’expression des miARN sériques et rénaux chez les souris présentant diverses pathologies. En raison de la simplicité du protocole, un grand nombre d’échantillons peuvent être traités simultanément. Les analyses de l’expression de nombreux miARN dans diverses conditions pathologiques du rein peuvent donc utiliser le protocole décrit ici.
Il y a certains aspects du protocole à garder à l’esprit. Pour éviter la dégradation des miARN purifiés qui se produirait à température ambiante, les miARN doivent être conservés sur de la glace. Les échantillons de rein doivent être homogénéisés jusqu’à ce qu’ils soient complètement dissous dans le réactif de lyse. Le rein de souris contient une quantité substantielle de tissu conjonctif qui est insoluble dans le réactif de lyse, et donc un broyeur de colonne est nécessaire pour une homogénéisation plus poussée. De plus, le miARN témoin endogène approprié (avec une expression stable parmi les échantillons) doit être validé tout au long de la mise en place d’une expérience qRT-PCR. En effet, l’interférence de diverses substances pendant l’exécution de ce protocole peut modifier les niveaux d’expression des miARN de contrôle endogènes, ce qui peut compromettre les résultats. En conclusion, cet article décrit un protocole qRT-PCR pour la détection, la purification et l’évaluation de l’expression des miARN dans le sérum et les reins de souris atteintes d’insuffisance rénale dépendante de l’âge.
The authors have nothing to disclose.
Aucun.
1.0 mL spitz with heparin | Greiner-bio-one | 450534 | |
Buffer RPE (wash buffer #2 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:4) | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
Buffer RWT (wash buffer #1 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:2) | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00003871 | 5'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU G-3' |
miRNA-423-5p primer | Qiagen | MS00012005 | 5'-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU UU-3' |
miRNA-7218-5p primer | Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG -3' |
miRNA-7219-5p primer | Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA GA-3' |
miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
miRNeasy Serum/Plasma kit | Qiagen | 217184 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
miScript II RT kit (reverse transcription buffer) | Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit |
miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit |
QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube |
QIAzol Lysis Reagent (phenol/guanidine-based lysis reagent) | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not disclosed due to confidentiality |
SAMP1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
SAMR1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
Takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer |