Количественная оценка полимеразной цепной реакции в режиме реального времени экспрессии микроРНК в почках и сыворотке мышей с возрастной почечной недостаточностью

Экспериментальный протокол был одобрен Комитетом по этике животных Медицинского университета Джичи и выполнен в соответствии с Руководством Медицинского университета Джичи для лабораторных животных и его руководящими принципами, касающимися использования и ухода за экспериментальными животными. Этот протокол использует четырех 50-недельных самцов мышей SAMR1 и самцов мышей SAMP1 (40-45 г). 1. Отбор образцов сыворотки Подготовьте для каждой мыши следующее: иглы 30 г со шприцем 1,0 мл, центрифугированную трубку шпица 1,0 мл с гепарином, микроцентрифужные трубки 1,5 мл, анестетик изофлуран, пробковый лист, 70% этанол, два ватных тампона, смоченных фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), чашку Петри с PBS, пинцет и хирургические ножницы. Обезболивают мышь 1,5% изофлураном и поддерживают на уровне 1,5%. Введите анальгетик (Мелоксикам 5 мг/кг) подкожно, затем введите 1,0 мл 70% этанола в брюшную полость и поместите его в лежачее положение на пробковом листе. Подтверждают глубину анестезии исчезновением рефлекса снятия педали. Пинцетом и хирургическими ножницами разрезают кожу живота. Отрежьте мышцы и брюшинную оболочку от мочевого пузыря до нижнего левого края ребер. Используйте пинцет, чтобы поднять перитонеальную мембрану, и сделайте боковой разрез в верхнем крае перитонеальной мембраны хирургическими ножницами. Продолжайте разрез вдоль нижнего края ребер. Определите нижнюю полую вену с помощью двух увлажненных PBS ватных тампонов. Вставьте одну из игл 30 Г со шприцем 1,0 мл в нижнюю полую вену, а затем потяните шприц. Медленно вытащите иглу из нижней полой вены, чтобы избежать гемолиза. Перенесите кровь в 1,0 мл шпицевой трубки с гепарином, а затем перемешайте ее, перевернув трубку несколько раз.ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь подвергается эвтаназии при вывихе шейки матки. Раскрутите трубку шпица при комнатной температуре (RT), 3000 × г в течение 10 мин. Медленно аспирируйте супернатант, убедитесь, что он не содержит осадка, а затем перенесите его в неиспользуемую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Храните тюбик при температуре −80 °C перед использованием.ПРИМЕЧАНИЕ: При немедленном переходе к этапу 3 трубку нет необходимости хранить при температуре −80 °C. 2. Забор проб почек Приготовьте для каждой мыши следующее: криотрубки объемом 2,0 мл, анестетик изофлуран, пробковый лист, 70% этанола, чашку Петри с PBS, пинцет и хирургические ножницы. Обезболивают мышь 1,5% изофлураном и поддерживают на уровне 1,5%. Введите анальгетик (Мелоксикам 5 мг / кг) подкожно, затем введите 1,0 мл 70% этанола в его брюшную полость и поместите его в лежачее положение на пробковом листе. Подтверждают глубину анестезии исчезновением рефлекса снятия педали. Используйте пинцет и хирургические ножницы, чтобы сделать разрез в коже живота. Отрежьте мышцы и брюшинную оболочку от мочевого пузыря до нижнего левого края ребер. Используйте пинцет, чтобы поднять перитонеальную мембрану и сделать боковой разрез в верхнем крае брюшинной мембраны хирургическими ножницами. Продолжайте разрез вдоль нижнего края ребер. Определите левую почку. Рефлюкс его с PBS для промывки крови из сосудов до тех пор, пока почка не приобретет желтовато-белый цвет. Сначала иссекните всю почку с помощью хирургических ножниц, чтобы разорвать левую почечную артерию и вену. Поместите почку в чашку Петри и тщательно вымойте ее с помощью PBS.ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь подвергается эвтаназии при вывихе шейки матки. Используйте пинцет и хирургические ножницы, чтобы разрезать почку на образцы 10 мг (10 мг – подходящий размер образца для следующего этапа). Поместите каждый образец почки в свою собственную криотрубу объемом 2,0 мл. Закройте крышку трубки. Для длительного хранения переложите каждую криотрубу в жидкий азот и храните ее при −80 °C. 3. Полное извлечение РНК из образца сыворотки Сначала подготовьте следующие продукты: вихревой смеситель, реагент лизиса на основе фенола/ гуанидина, 80% этанол, 100% этанол, 100% хлороформ, спиновые колонки биополимера (в коллекторных трубках2,0 мл 11), мембранно-закрепленные спиновые колонны (в трубках сбора11 2,0 мл), промывочный буфер No 1 (т.е. буфер промывки, содержащий гуанидин и 100% этанол в соотношении 1:2), буфер промывки No 2 (т.е. промывочный буфер, содержащий гуанидин и 100% этанол в соотношении 1:4), воду без РНКазы, микроцентрифужные трубки 1,5 мл и микроцентрифужные трубки 2,0 мл. Сначала возьмите образец сыворотки объемом 200 мкл в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл, а затем добавьте 1000 мкл реагента лизиса на основе фенола / гуанидина. Вихрь смеси в течение 5 с. Инкубируйте образец на RT в течение 5 мин. Добавьте 200 мкл хлороформа к образцу сыворотки в пробирке и плотно закройте крышку пробирки. Инвертируйте пробирку 15x, чтобы смешать хлороформ и образец сыворотки. Каждый образец инкубируется на RT в течение 3 мин. Затем открутите образец при 4 °C в течение 15 мин при 12 000 х г. Перенесите 300 мкл супернатанта в новую микроцентрифужную трубку емкостью 1,5 мл, не нарушая гранулу. Добавьте 450 мкл 100% этанола и вращайте трубку в течение 5 с.ПРИМЕЧАНИЕ: На всех следующих этапах поместите мембранно-закрепленную спиновую колонну для разделения РНК и ДНК в пробирку для сбора 2,0 мл, чтобы центрифугировать ее. Затем извлеките 700 мкл образца, загрузите его на спиновую колонну с мембранным креплением и закройте колпачок. Раскрутите колонку при RT в течение 15 с при 8000 × g и оставьте супернатант в колонке. Выбросьте гранулы, оставшиеся в коллекционной трубке. Добавьте 700 мкл промывочного буфера No1, который является частью набора сыворотки/плазмы (см. Таблицу материалов) в мембранную спиновую колонну для тщательной очистки образца. Закройте крышку столбца и раскрутите столбец на RT в течение 15 с при 8000 × g, и оставьте супернатант в столбце. Выбросьте гранулы, оставшиеся в коллекционной трубке. Для удаления следов солей возьмите 500 мкл промывочного буфера No2 и загрузите его на мембранно-закрепленную спиновую колонну. После закрытия колпачка колонки раскрутите колонку на RT в течение 15 с при 8000 × g и оставьте супернатант в колонке. Выбросьте гранулу в коллекционную трубку. Для удаления следов солей возьмите 500 мкл 80% этанола и загрузите его на мембранную спиновую колонну. После закрытия колпачка колонки раскрутите колонку на RT в течение 15 с при 8000 × g и оставьте супернатант в колонке. Выбросьте гранулу в коллекционную трубку. Снова раскрутите спиновую колонну с мембранным креплением при RT в течение 5 мин при 15 000 × г. После переноса спиновой колонны с мембранным креплением в новую коллекторную трубку объемом 1,5 мл добавьте в колонну 14 мкл войны без РНКазы, чтобы растворить общую РНК. После закрытия крышки колонны подождите 5 мин, оставив трубку на RT. Снова вращайте колонну в течение 1 мин при 15 000 × г при RT. Храните пробирки с образцами при температуре −80 °C перед использованием. 4. Извлечение общей РНК из образца почки Сначала подготовьте следующие продукты: гомогенизатор кремния, лед, вихревой смеситель, 100% этанол, 100% хлороформ, спиновые колонки биополимера (в коллекторных трубках2,0 мл 11), спиновые колонны с мембранным креплением (в трубках сбора2,0 мл 11), реагент лизиса на основе фенола / гуанидина, промывочный буфер No 1 (тот же буфер, что и на этапе 3.1.), буфер промывки No 2 (тот же буфер, что и на этапе 3.1.), буфер для промывки No 2 (тот же буфер, что и на этапе 3.1.), Вода без РНКазы, микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл и микроцентрифужные трубки объемом 2,0 мл. Поместите образец почки 10 мг в гомогенизатор кремния и добавьте 700 мкл реагента лизиса на основе фенола / гуанидина. Настройте гомогенизатор. Осторожно надавите и скрутите пестик гомогенизатора к образцу почки, чтобы гомогенизировать образец. Продолжайте прессовать и скручивать пестик до тех пор, пока образец почки не будет полностью гомогенизирован в реагенте лизиса на основе фенола / гуанидина. Для дальнейшей гомогенизации берут гомогенизированный лизат (в пробирке для сбора 2,0 мл) и переносят его в спиновую колонну биополимера. Центрифугировать гомогенизированный лизат на RT в течение 3 мин при 14 000 × г , а затем перенести всю осажденную гранулу в неиспользуемую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл для инвертирования осажденной гранулы Смешать гранулу со 140 мкл хлороформа в пробирке; затем плотно закройте крышку трубки. Переверните трубку 15x, чтобы смешать лизат и хлороформ.ПРИМЕЧАНИЕ: Хлороформ можно безопасно использовать без капюшона. Инкубировать образец на RT в течение 2-3 мин. Центрифугирование образца при 4 °C в течение 15 мин при 12 000 × г. Перенесите супернатант (который обычно составляет ~300 мкл) в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл, не нарушая осадок. Добавьте в 1,5 раза больше его объема (который обычно составляет ~ 450 мкл) 100% этанола. Вихрь смеси в течение 5 с.ПРИМЕЧАНИЕ: На всех следующих этапах поместите мембранно-закрепленную спиновую колонну для разделения РНК и ДНК в пробирку для сбора 2,0 мл, чтобы центрифугировать ее. Загрузите 700 мкл образца на одну из спиновых колонн с мембранным креплением. Закройте колпачок и центрифугируйте колонну при 15 000 × g в течение 15 с. Выбросьте осажденный лизат, оставшийся в сборной трубке. Добавьте 700 мкл промывочного буфера No1 в отжимную колонну, чтобы тщательно промыть ее. Закройте колпачок и центрифугируйте колонну при 15 000 × g в течение 15 с. Выбросьте осажденный лизат, оставшийся в сборной трубке. Для удаления следовых количеств соли загрузите 500 мкл промывочного буфера No2 на мембранно-закрепленную спиновую колонну. После закрытия колпачка колонны центрифугируют колонну при 15 000 × g в течение 15 с. Выбросьте осажденный лизат в сборную трубку. Повторите шаг 4.11. Центрифугировать мембранно-закрепленную спиновую колонну снова в течение 1 мин при 15 000 × г. Выбросьте осажденный лизат в сборную трубку. Возьмите отжимную колонну с мембранным креплением и перенесите ее в новую трубку для сбора 1,5 мл. Добавьте 30 мкл воды без РНКазы в столб, чтобы растворить общую РНК. После закрытия колпачка колонны подождите 5 мин с трубкой на RT, а затем центрифугируйте колонну в течение 1 мин при 15 000 × г. Перенесите общий объем образца, содержащего общую РНК, в новую микроцентрифужную трубку. Поместите трубку на лед и измерьте общую концентрацию РНК с помощью спектрофотометрии. Убедитесь, что общая концентрация РНК составляет ~300-1 500 нг/мкл. Храните пробирки, содержащие образцы, при температуре −80 °C перед использованием. 5. Синтез кДНК с обратной транскрипцией общей РНК в сыворотке крови ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальная информация для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени (MIQE) рекомендует использовать лучшие экспериментальные практики для получения надежных, однозначных результатов17. В этом протоколе кДНК синтезируется из общей РНК, очищенной в двухэтапной процедуре с использованием обратной транскриптазы, поли(А) полимеразы и олиго-dT праймеров. Сначала подготовьте следующий: вихревой смеситель, термоциклер, восьмилуночные ленточные трубки, колпачок каждой восьмиполосной трубки, дистиллированную воду, лед, набор обратной транскриптазы (см. Таблицу материалов)13,14 в расплавленном состоянии и 1,5 мл микроцентрифужных трубок. Запустите термоциклер. Приготовить раствор мастер-микса; для получения в общей сложности 8,0 мкл мастер-смеси на восьмилуночную полосную трубку добавляют 2,0 мкл смеси обратной транскриптазы (входит в комплект) и 2,0 мкл 10-кратной смеси нуклеиновых кислот к 4,0 мкл буфера обратной транскрипции в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл. Поместите 8,0 мкл раствора основной смеси в каждую трубу восьмискважинной ленточной трубы. Поместите 12 мкл аликвоты общей РНК в каждую трубку восьмилуночной полосчатой трубки и закройте крышку трубки. Центрифугирование трубки в течение 15 с при РТ и 2000 × г. Поместите трубку в термоциклер и инкубируйте в течение 60 мин при 37 °C. Инкубируют образец в течение дополнительных 5 мин при 95 °C мин для синтеза кДНК. После инкубации перенесите кДНК в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Разбавьте кДНК десятикратно (1:10) дистиллированной водой. Вихрь и центрифуга трубки в течение 5 с при РТ и 2000 × г. Храните разбавленную кДНК временно на льду. Храните разбавленные образцы при температуре −80 °C перед использованием. 6. Синтез кДНК с обратной транскрипцией общей РНК в почках ПРИМЕЧАНИЕ: Руководящие принципы MIQE поощряют более совершенную экспериментальную практику для обеспечения надежных и недвусмысленных результатов17. Этот протокол использует обратную транскриптазу, поли(А) полимеразу и олиго dT праймеры для синтеза кДНК из 1,0 мкг очищенной общей РНК в двухэтапной процедуре. Сначала подготовьте следующее: вихревой смеситель, тепловой циклер, микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл, восьмискважинные ленточные трубки, крышку каждой восьмиполосной трубки, дистиллированную воду, лед и комплект обратной транскриптазы (см. Таблицу материалов)13,14 в расплавленном состоянии. Запустите термоциклер. Приготовить раствор мастер-микса; для получения в общей сложности 8,0 мкл раствора мастер-микса на пробирку добавляют 2,0 мкл смеси обратной транскриптазы, входящей в комплект, и 2,0 мкл 10-кратной смеси нуклеиновых кислот к 4,0 мкл буфера обратной транскрипции. Добавьте 8,0 мкл раствора основной смеси в каждую трубу восьмилуночной ленточной трубы. Отрегулируйте общую плотность РНК следующим образом. Для отделения 1,0 мкг общей РНК от образца почки с 12 мкл рваазной воды берут подходящее количество общей РНК и переносят ее в дистиллированную воду, используя концентрацию, измеренную, как описано выше (на этапе 4.15.).ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии загрязнения ДНК загрязненная ДНК совместно амплодируется с помощью qRT-PCR. Выполните тот же процесс, что и описанный выше в шагах 5.5.-5.8. 7. qRT-PCR миРНК ПРИМЕЧАНИЕ: Для qRT-ПЦР миРНК используется интеркаляторный метод. Для РНК используются праймеры: U6 малый ядерный 2 (RNU6-2), miRNA-223-3p, miRNA-423-5p, miRNA-7218-5p и miRNA-7219-5p. Подготовьте следующее: вихревой смеситель, систему ПЦР в режиме реального времени, реакционную пластину с 96 лунками для qRT-PCR, клейкую пленку для реакционной пластины с 96 лунками, аппликатор клейкой пленки, ротор центрифуги с 96 лунками, праймеры, специфичные для миРНК, набор ПЦР на основе зеленого красителя, содержащий 2-кратную главную смесь ПЦР и 10-кратную универсальную грунтовку (см. Таблицу материалов)13,14, и микроцентрифужная трубка объемом 1,5 мл. После смешивания их в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл вихрь: 6,25 мкл дистиллированной воды, 1,25 мкл каждого из 5 мкМ праймера миРНК, растворенного в воде без нуклеазы, 12,5 мкл 2x ПЦР-мастер-смеси и 2,5 мкл 10x универсального праймера. Подготовьте и расплавьте синтезированную кДНК, как описано на этапе 5 (сыворотка) или этапе 6 (почка). Вихрь и центрифугирование кДНК в течение 5 с. Возьмите 22,5 мкл аликвот реагента (как описано в шаге 7.2. выше) и поместите их отдельно в каждую лунку 96-луночной пластины. Добавьте 2,5 мкл аликвоты кДНК к каждой лунке пластины. Чтобы закрепить клейкую пленку на пластине, используйте аппликатор клейкой пленки. Центрифугирование пластины в течение 30 с при 1000 х г в 96-луночном центрифужном роторе. Стабилизируйте реакцию на дне каждой скважины. 8. Использование системы и программного обеспечения ПЦР в режиме реального времени для запуска программы цикличности ПЦР Запустите систему ПЦР в режиме реального времени. Поместите созданную пластину, как описано в шаге 7.6. в системе ПЦР реального времени. Измените настройки; укажите название эксперимента, а затем выберите 96-луночную скважину (0,2 мл) в качестве типа эксперимента системы, сравнительную КТ (ΔΔCT) в качестве метода количественного определения, стандартную в качестве режима работы системы и зеленые реагенты SYBR в качестве реагентов для обнаружения целевой последовательности. Укажите имена для образца и целевых миРНК, а также назовите образец и целевую миРНК в каждой лунке. Назначьте дубликаты образцов для получения данных, пригодных для подтверждения результатов, и выберите эталонный образец и эндогенный контроль. Чтобы краситель использовался в качестве пассивного эталона, выберите «Нет». Для устранения перекрестного загрязнения реагентов настройте отрицательную обратную транскриптазу и нешаблонный контроль экспрессии миРНК. Затем убедитесь, что объем реакции установлен на 20 мкл , а условия цикла ПЦР установлены следующим образом: 95 °C в течение 15 мин, затем 40 циклов денатурации при 94 °C в течение 15 с, отжиг при 55 °C в течение 30 с и, наконец, удлинение при 70 °C в течение 30 с. Нажмите на анализ в программном обеспечении системы, чтобы проанализировать данные qRT-PCR после завершения процесса. Убедитесь, что пороговая линия, автоматически выбранная программой, подходит для каждой скважины. Проверьте значение порогового цикла (КТ) эндогенного контроля и целевых микроРНК, проанализированных в каждом образце. Определите значения КТ по пересечению кривой усиления и пороговой линии.ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании RNU6-2 и miRNA-423-5p использовались в качестве эндогенных элементов контроля для уровней экспрессии целевой миРНК, а метод ΔΔCT использовался для определения относительных уровней экспрессии каждой целевой миРНК18.