הערכת תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת של ביטוי מיקרו-רנ"א בכליות ובסרום של עכברים עם פגיעה כלייתית תלוית גיל

פרוטוקול הניסוי אושר על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית ג’יצ’י ובוצע בהתאם למדריך האוניברסיטה הרפואית של ג’יצ’י לחיות מעבדה והנחיותיו בנוגע לשימוש וטיפול בחיות ניסוי. פרוטוקול זה משתמש בארבעה עכברים זכרים SAMR1 בני 50 שבועות ובעכברים זכרים SAMP1 (40-45 גרם). 1. איסוף דגימות בסרום הכינו את הדברים הבאים לכל עכבר: מחטי 30 G עם מזרק 1.0 מ”ל, צינור צנטריפוגה ספיץ 1.0 מ”ל עם הפרין, צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ”ל, הרדמה איזופלוראן, יריעת שעם, 70% אתנול, שני מקלוני צמר גפן טבולים בתמיסת מלח עם פוספט (PBS), צלחת פטרי עם PBS, פינצטה ומספריים כירורגיים. הרדמת העכבר עם 1.5% איזופלוראן ולשמור על 1.5%. לתת משכך כאבים (Meloxicam 5 מ”ג / ק”ג) תת עורית, ולאחר מכן להזריק 1.0 מ”ל של 70% אתנול לתוך הבטן שלה ומניחים אותו במצב שכיבה על יריעת הפקק. אשר את עומק ההרדמה על ידי היעלמות רפלקס נסיגת הדוושה. עם פינצטה ומספריים כירורגיים, לחתוך את העור של הבטן. חותכים את השרירים ואת קרום הצפק משלפוחית השתן לקצה השמאלי התחתון של הצלעות. השתמש בפינצטה כדי להרים את קרום הצפק, ולעשות חתך לרוחב בקצה העליון של קרום הצפק עם מספריים כירורגי. ממשיכים את החתך לאורך הקצה הנמוך ביותר של הצלעות. זהה את הווריד הנבוב התחתון באמצעות שני מקלוני הכותנה הלחים של PBS. הכנס אחת ממחטי 30 G עם מזרק 1.0 מ”ל לתוך הווריד הנבוב התחתון ולאחר מכן למשוך את המזרק. משוך את המחט מתוך הווריד הנבוב התחתון באיטיות כדי למנוע המוליזה. העבר את הדם לצינור spitz 1.0 מ”ל עם הפרין ולאחר מכן לערבב אותו על ידי היפוך הצינור מספר פעמים.הערה: העכבר מורדם על ידי נקע צוואר הרחם. סובב את צינור השפיץ בטמפרטורת החדר (RT), 3,000 × גרם למשך 10 דקות. שאפו את הסופרנטנט באיטיות, וודאו שהוא אינו מכיל משקעים, ולאחר מכן העבירו אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ”ל שאינו בשימוש. יש לאחסן את השפופרת בטמפרטורה של −80°C לפני השימוש.הערה: אם ממשיכים לשלב 3 באופן מיידי, אין צורך לאחסן את הצינור בטמפרטורה של −80 °C. 2. איסוף דגימות כליה הכן את הדברים הבאים עבור כל עכבר: 2.0 mL cryotubes, הרדמה איזופלוראן, גיליון שעם, 70% אתנול, צלחת פטרי עם PBS, פינצטה, ומספריים כירורגיים. הרדמת העכבר עם 1.5% איזופלוראן ולשמור על 1.5%. לתת משכך כאבים (Meloxicam 5 מ”ג / ק”ג) תת עורית, ולאחר מכן להזריק 1.0 מ”ל של 70% אתנול לתוך הבטן שלה, ומניחים אותו במצב שכיבה על יריעת הפקק. אשר את עומק ההרדמה על ידי היעלמות רפלקס נסיגת הדוושה. השתמש בפינצטה ובמספריים כירורגיים כדי לבצע חתך בעור הבטן. חותכים את השרירים ואת קרום הצפק משלפוחית השתן לקצה השמאלי התחתון של הצלעות. השתמש בפינצטה כדי להרים את קרום הצפק ולבצע חתך לרוחב בקצה העליון של קרום הצפק עם מספריים כירורגיים. ממשיכים את החתך לאורך הקצה הנמוך ביותר של הצלעות. זהה את הכליה השמאלית. ריפלוקס זה עם PBS כדי לשטוף את הדם מן כלי הדם עד הכליה הופכת צבע צהבהב לבן. כלו את הכליה כולה תחילה באמצעות מספריים כירורגיים כדי לנתק את עורק הכליה השמאלי ואת הווריד. מניחים את הכליה בצלחת פטרי ושוטפים אותה בזהירות עם PBS.הערה: העכבר מורדם על ידי נקע צוואר הרחם. השתמש בפינצטה ובמספריים הכירורגיים כדי לחתוך את הכליה לדגימות של 10 מ”ג (10 מ”ג הוא גודל מדגם מתאים לשלב הבא). מניחים כל דגימה של הכליה ב cryotube 2.0 מ”ל משלה. סגור את מכסה הצינור. לאחסון לטווח ארוך, העבר כל cryotube לחנקן נוזלי ואחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס. 3. סה”כ מיצוי RNA מדגימת סרום הכינו תחילה את הפריטים הבאים: מערבל מערבולות, מגיב ליזיס על בסיס פנול/גואנידין, 80% אתנול, 100% אתנול, 100% כלורופורם, עמודות ספין ביופולימריות (בצינורות איסוף של 2.0 מ”ל 11), עמודי ספין מעוגנים בממברנה (בצינורות איסוף של 2.0 מ”ל11), חיץ כביסה #1 (כלומר, חיץ כביסה המכיל גואנידיןו-100% אתנול ביחס של 1:2), חיץ כביסה #2 (כלומר, חיץ רחצה המכיל גואנידין ו-100% אתנול ביחס של 1:4), מים ללא RNase, צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ”ל וצינורות מיקרוצנטריפוגה 2.0 מ”ל. ראשית, קח דגימת סרום של 200 μL בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ”ל, ולאחר מכן הוסף 1,000 μL של מגיב ליזה מבוסס פנול/גואנידין. מערבבים את התערובת במשך 5 שניות. דגירה של הדגימה ב-RT למשך 5 דקות. הוסף 200 μL של כלורופורם לדגימת הסרום בצינור וסגור את מכסה הצינור בחוזקה. הפוך את הצינור פי 15 כדי לערבב את הכלורופורם ואת דגימת הסרום. כל דגימה דוגרת ב- RT למשך 3 דקות. לאחר מכן, סובב את הדגימה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ב-12,000 x גרם. העבר את 300 μL של supernatant לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ”ל מבלי להפריע לכדור. מוסיפים 450 μL של 100% אתנול, ומערבבים את הצינור במשך 5 שניות.הערה: בכל השלבים הבאים, מקם את עמודת הספין המעוגנת בממברנה להפרדת RNA ו- DNA בצינור איסוף של 2.0 מ”ל כדי לבצע צנטריפוגה. לאחר מכן, הסר 700 μL של הדגימה, לטעון אותו על עמוד ספין מעוגן ממברנה, ולסגור את הפקק. סובב את העמודה ב-RT במשך 15 שניות ב-8,000 × גרם, והשאר את הסופר-נאטנט בעמודה. השליכו את הכדור שנותר בצינור האיסוף. הוסף 700 μL של מאגר כביסה #1 המהווה חלק מהסרום/ערכת הפלזמה (ראה טבלת החומרים) לעמודת הספין המעוגנת בממברנה כדי לנקות את הדגימה ביסודיות. סגור את מכסה העמודה וסובב את העמודה ב- RT למשך 15 שניות ב- 8,000 × גרם, והשאר את הסופר-נאטנט בעמודה. השליכו את הכדור שנותר בצינור האיסוף. להסרת מלחי קורט, קח 500 μL של מאגר לשטוף #2 ולטעון אותו על עמוד ספין מעוגן ממברנה. לאחר סגירת מכסה העמודה, סובב את העמודה ב- RT למשך 15 שניות ב- 8,000 × גרם, והשאר את ה- supernatant בעמודה. השליכו את הכדור בצינור האיסוף. להסרת מלחי קורט, לקחת 500 μL של 80% אתנול לטעון אותו על עמוד ספין מעוגן קרום. לאחר סגירת מכסה העמודה, סובב את העמודה ב- RT למשך 15 שניות ב- 8,000 × גרם, והשאר את ה- supernatant בעמודה. השליכו את הכדור בצינור האיסוף. סובב שוב את עמודת הספין המעוגנת בממברנה ב-RT למשך 5 דקות ב-15,000 × גרם. לאחר העברת עמודת הספין המעוגנת בממברנה לצינור איסוף חדש של 1.5 מ”ל, הוסיפו 14 מיקרון של מים נטולי RNase לעמודה כדי להמיס את הרנ”א הכולל. לאחר סגירת מכסה העמודה, המתן 5 דקות עם הצינור שנותר ב- RT. סובב את העמודה שוב למשך דקה אחת ב- 15,000 × גרם ב- RT. יש לאחסן את הצינורות עם דגימות בטמפרטורה של −80°C לפני השימוש. 4. מיצוי סך הרנ”א מדגימת כליה הכינו תחילה את הפריטים הבאים: הומוגנייזר סיליקון, קרח, מערבל מערבולות, 100% אתנול, 100% כלורופורם, עמודות ספין ביופולימריות (בצינורות איסוף של 2.0 מ”ל 11), עמודי ספין מעוגנים בממברנה (בצינורות איסוף של 2.0 מ”ל11), ריאגנט ליזה מבוסס פנול/גואנידין, מאגר שטיפה #1 (אותו חיץ כמו שלב 3.1.), מאגר כביסה #2 (אותו חיץ כמו שלב 3.1.), מים ללא RNase, צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ”ל וצינורות מיקרוצנטריפוגה 2.0 מ”ל. יש להניח דגימת כליה של 10 מ”ג בסיליקון הומוגנייזר, ולהוסיף 700 μL של מגיב ליזה על בסיס פנול/גואנידין. הגדר את ההומוגנייזר. לחצו בעדינות וסובבו את המזיק של ההומוגנייזר כנגד דגימת הכליה כדי ליצור הומוגניזציה של הדגימה. המשיכו ללחוץ ולסובב את המזיק עד שדגימת הכליה תהיה הומוגנית לחלוטין בריאגנט המבוסס על פנול/גואנידין. להומוגניזציה נוספת, קח את הליזאט ההומוגני (בצינור איסוף של 2.0 מ”ל) והעבר אותו לעמודת ספין ביופולימר. צנטריפוגה הליזאט ההומוגני ב-RT למשך 3 דקות ב-14,000 × גרם ולאחר מכן העברת כל הכדור המשופע לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ”ל שאינו בשימוש כדי להפוך את הכדור המשופע מערבבים את הכדור עם 140 μL של כלורופורם בצינור; לאחר מכן, סגור את מכסה הצינור בחוזקה. הפוך את הצינור פי 15 כדי לערבב את הליזאט והכלורופורם.הערה: ניתן להשתמש בכלורופורם בבטחה ללא מכסה מנוע. דגירה של הדגימה ב-RT למשך 2-3 דקות. צנטריפוגה של הדגימה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ב-12,000 × גרם. העבר את הסופר-נטנט (שהוא בדרך כלל ~ 300 μL) לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ”ל, מבלי להפריע למשקע. הוסף פי 1.5 מנפחו (שהוא בדרך כלל ~ 450 μL) של 100% אתנול. מערבבים את התערובת במשך 5 שניות.הערה: בכל השלבים הבאים, מקם את עמודת הספין המעוגנת בממברנה להפרדת RNA ו- DNA בצינור איסוף של 2.0 מ”ל כדי לבצע צנטריפוגה. טען 700 μL של דגימה על אחד מעמודי הספין המעוגנים בממברנה. סגרו את המכסה וצנטריפוגה של העמודה ב-15,000 × גרם למשך 15 שניות. יש להשליך את הליזאט המשופע שנותר בצינור האיסוף. הוסף 700 μL של מאגר כביסה #1 לעמודת הסיבוב כדי לשטוף אותו ביסודיות. סגרו את המכסה וצנטריפוגה של העמודה ב-15,000 × גרם למשך 15 שניות. יש להשליך את הליזאט המשופע שנותר בצינור האיסוף. להסרת כמויות קורט של מלח, לטעון 500 μL של מאגר לשטוף #2 על עמוד ספין מעוגן ממברנה. לאחר סגירת מכסה העמודה, צנטריפוגה העמודה ב 15,000 × גרם במשך 15 שניות. השליכו את הליזאט המואץ בצינור האיסוף. חזור על שלב 4.11. צנטריפוגה עמודת ספין מעוגן קרום שוב במשך דקה אחת ב 15,000 × גרם. השליכו את הליזאט המואץ בצינור האיסוף. קח את עמוד הספין המעוגן בממברנה והעבר אותו לצינור איסוף חדש של 1.5 מ”ל. הוסיפו 30 μL של מים נטולי RNase לעמודה כדי להמיס את הרנ”א הכולל. לאחר סגירת מכסה העמודה, המתן 5 דקות עם הצינור ב- RT, ולאחר מכן צנטריפוגה של העמודה למשך דקה אחת ב- 15,000 × גרם. העבר את הנפח הכולל של הדגימה המכילה RNA כולל לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש. מניחים את הצינור על קרח, ומודדים את ריכוז הרנ”א הכולל על ידי ספקטרופוטומטריה. ודא שריכוז הרנ”א הכולל הוא ~300-1,500 ng/μL. יש לאחסן צינורות המכילים דגימות בטמפרטורה של −80°C לפני השימוש. 5. סינתזה של cDNA עם שעתוק הפוך של סך RNA בסרום הערה: המידע המינימלי לפרסום הנחיות כמותי לניסויי PCR בזמן אמת (MIQE) ממליץ להשתמש בשיטות ניסוי טובות יותר כדי להשיג תוצאות אמינות וחד-משמעיות17. בפרוטוקול זה, cDNA מסונתז מסך הרנ”א המטוהר בהליך דו-שלבי באמצעות טרנסקריפטאז הפוך, פולי(A) פולימראז ופריימרים oligo-dT. הכן תחילה את הדברים הבאים: מערבל מערבולות, מחזור תרמי, צינורות רצועה של שמונה בארות, המכסה של כל צינור בעל שמונה רצועות, מים מזוקקים, קרח, ערכת הטרנסקריפטאז ההפוכה (ראה טבלת החומרים)13,14 במצב המומס, וצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ”ל. הפעל את מחזור תרמי. הכן את פתרון תערובת האב; כדי לקבל סך של 8.0 μL של תערובת מאסטר לכל צינור רצועה של שמונה בארות, הוסף 2.0 μL של תערובת טרנסקריפטאז הפוכה (כלולה בערכה) ו-2.0 μL של תערובת של 10x חומצות גרעין ל-4.0 μL של חיץ שעתוק הפוך בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ”ל. הנח 8.0 μL של תמיסת תערובת האב בכל צינור של צינור רצועה שמונה בארות. מניחים 12 μL aliquot של RNA כולל בכל צינור של צינור רצועת שמונה בארות, ולסגור את מכסה הצינור. צנטריפוגה של הצינור במשך 15 שניות ב- RT ו- 2,000 × גרם. מניחים את הצינור במחזור התרמי ודוגרים במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. דגירה של הדגימה למשך 5 דקות נוספות ב-95 מעלות צלזיוס דקה כדי לסנתז את ה-cDNA. לאחר הדגירה, העבירו את ה-cDNA לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ”ל. יש לדלל את ה-cDNA פי עשרה (1:10) במים מזוקקים. מערבולת וצנטריפוגה של הצינור במשך 5 שניות ב-RT ו-2,000 × גרם. אחסנו את ה-cDNA המדולל באופן זמני על קרח. יש לאחסן את הדגימות המדוללות בטמפרטורה של −80°C לפני השימוש. 6. סינתזה של cDNA עם שעתוק הפוך של RNA הכולל בכליות הערה: הנחיות MIQE מעודדות שיטות ניסוי טובות יותר כדי להבטיח תוצאות אמינות וחד משמעיות17. פרוטוקול זה משתמש ב-reverse transcriptase, poly(A) polymerase ו-oligo dT פריימרים כדי לסנתז cDNA מ-1.0 מיקרוגרם של רנ”א מטוהר בהליך דו-שלבי. ראשית, הכינו את הדברים הבאים: מערבל מערבולות, מחזור תרמי, צינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ”ל, צינורות רצועה של שמונה בארות, המכסה של כל צינור בעל שמונה רצועות, מים מזוקקים, קרח וערכת טרנסקריפטאז הפוכה (ראו טבלת חומרים)13,14 במצב מומס. הפעל את מחזור תרמי. הכן את פתרון תערובת האב; כדי לקבל סך של 8.0 μL של תמיסת תערובת מאסטר לכל צינור, הוסף 2.0 μL של תערובת transcriptase הפוכה הכלולה בערכה ו 2.0 μL של תערובת חומצת גרעין 10x ל 4.0 μL של חיץ שעתוק הפוך. הוסף 8.0 μL של תמיסת תערובת האב לכל צינור של צינור רצועה שמונה בארות. התאם את צפיפות הרנ”א הכוללת באופן הבא. להפרדת 1.0 מיקרוגרם של RNA כולל מדגימת כליה עם 12 μL של מים נטולי RNase, קח כמות מתאימה של RNA כולל והעבר אותו למים מזוקקים באמצעות הריכוז שנמדד כמתואר לעיל (בשלב 4.15.).הערה: בנוכחות זיהום דנ”א, הדנ”א המזוהם מוגבר במשותף על-ידי qRT-PCR. בצע את אותו התהליך המתואר לעיל בשלבים 5.5.-5.8. 7. qRT-PCR של miRNA הערה: שיטת אינטרקלטור משמשת עבור qRT-PCR של miRNAs. פריימרים משמשים לרנ”א: U6 גרעיני קטן 2 (RNU6-2), miRNA-223-3p, miRNA-423-5p, miRNA-7218-5p ו- miRNA-7219-5p. הכן את הדברים הבאים: מערבל מערבולות, מערכת PCR בזמן אמת, צלחת תגובה 96 בארות עבור qRT-PCR, סרט דבק עבור צלחת התגובה 96-well, אפליקטור סרט דבק, רוטור צנטריפוגה 96-well, פריימרים ספציפיים miRNA, ערכת PCR מבוססת צבע ירוק המכילה 2x PCR מאסטר תערובת ו 10x פריימר אוניברסלי (ראה טבלת החומרים)13,14, וצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ”ל. מערבולות את הדברים הבאים לאחר ערבובם בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ”ל: 6.25 μL של מים מזוקקים, 1.25 μL כל אחד של 5 μM miRNA פריימר מומס במים נטולי נוקלאז, 12.5 μL של 2x PCR תערובת מאסטר, ו 2.5 μL של 10x פריימר אוניברסלי. הכינו והמיסו את ה-cDNA המסונתז כמתואר בשלב 5 (סרום) או שלב 6 (כליות). מערבולת וצנטריפוגה של ה-cDNA במשך 5 שניות. קח 22.5 μL aliquots של מגיב (כמתואר בשלב 7.2. לעיל) ולהניח אותם בנפרד בכל באר של צלחת 96 באר. הוסף 2.5 μL aliquot של cDNA לכל באר של הצלחת. כדי להצמיד את סרט ההדבקה לצלחת, השתמש באפליקטור סרט הדבקה. צנטריפוגה את הצלחת במשך 30 שניות ב 1,000 x גרם ברוטור צנטריפוגה 96 באר. ייצוב התגובה בתחתית כל באר. 8. שימוש במערכת ותוכנת PCR בזמן אמת להפעלת תוכנית מחזור PCR התחל את מערכת ה-PCR בזמן אמת. הנח את הצלחת שנוצרה כמתואר בשלב 7.6. במערכת PCR בזמן אמת. שנה את ההגדרות; ספק שם לניסוי, ולאחר מכן בחר 96-well (0.2 מ”ל ) כסוג הניסוי של המערכת, CT השוואתי (ΔΔCT) כשיטת הכמות, סטנדרטי כמצב הפעלת המערכת, וריאגנטים ירוקים של SYBR כריאגנטים לזיהוי רצף המטרה. ספק שמות עבור הדגימה ועבור miRNAs היעד, ותן שם לדגימה ול- miRNA היעד בכל באר. הקצה דגימות כפולות כדי לקבל נתונים המתאימים לאישור התוצאות, ובחר דגימת ייחוס ואת הבקרה האנדוגנית. כדי שהצבע ישמש כהפניה הפסיבית, בחר ללא. כדי למנוע זיהום צולב מגיב, הגדר טרנסקריפטאז הפוך שלילי ובקרה שאינה תבנית לביטוי miRNA. לאחר מכן, ודא שנפח התגובה מוגדר ל – 20 μL ותנאי מחזור ה- PCR מוגדרים כדלקמן: 95 ° C למשך 15 דקות, לאחר מכן 40 מחזורים של דנטורציה ב- 94 ° C למשך 15 שניות, חישול ב- 55 ° C למשך 30 שניות, ולבסוף הארכה ב- 70 ° C למשך 30 שניות. לחץ על נתח בתוכנת המערכת כדי לנתח את נתוני qRT-PCR לאחר השלמת התהליך. ודא ששורת הסף שנבחרה באופן אוטומטי על-ידי התוכנית מתאימה לכל באר. בדוק את ערך מחזור הסף (CT) של הבקרה האנדוגנית ואת miRNAs היעד שנותחו בכל דגימה. קבע את ערכי ה- CT לפי ההצטלבות של עקומת ההגברה וקו הסף.הערה: במחקר הנוכחי, RNU6-2 ו- miRNA-423-5p שימשו כבקרות אנדוגניות עבור רמות ביטוי miRNA מטרה, ושיטת ΔΔCT שימשה כדי לקבוע את רמות הביטוי היחסיות של כל miRNA מטרה18.