加齢性腎障害マウスの腎臓および血清におけるマイクロRNA発現の定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応評価

実験プロトコルは、自治医科大学の動物倫理委員会によって承認され、自治医科大学実験動物ガイドおよびその実験動物の使用と管理に関するガイドラインに従って実施されました。このプロトコルは、4匹の50週齢のSAMR1オスマウスとSAMP1オスマウス(40〜45 g)を使用します。 1.血清サンプル収集 各マウスについて以下を準備します:1.0 mLシリンジ付き30 G針、ヘパリンを含む1.0 mLスピッツ遠心分離チューブ、1.5 mLマイクロ遠心チューブ、イソフルラン麻酔薬、コルクシート、70%エタノール、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で湿らせた2つの綿棒、PBS、ピンセット、および外科用はさみを備えたペトリ皿。 マウスを1.5%イソフルランで麻酔し、1.5%に維持する。鎮痛剤(メロキシカム5 mg / kg)を皮下投与し、1.0 mLの70%エタノールを腹部に注入し、コルクシートの仰臥位に置きます。. ペダル離脱反射の消失による麻酔深度を確認する。ピンセットと外科用ハサミで、腹部の皮膚を切開します。筋肉と腹膜を膀胱から肋骨の左下端まで切ります。 ピンセットを使用して腹膜を持ち上げ、外科用ハサミで腹膜の上端を横方向に切開します。肋骨の下端に沿って切開を続けます。 PBSで湿らせた2本の綿棒を使用して、下大静脈を特定します。1.0 mLシリンジを含む30 G針の1本を下大静脈に挿入し、シリンジを引きます。溶血を避けるために、下大静脈から針をゆっくりと引き出します。血液をヘパリンと一緒に1.0mLスピッツチューブに移し、チューブを数回反転させて混合します。注:マウスは頸部脱臼によって安楽死させられます。 スピッツ管を室温(RT)で3,000 × g で10分間回転させます。 上清をゆっくりと吸引し、沈殿物が含まれていないことを確認してから、未使用の1.5mLマイクロ遠心チューブに移します。 使用前にチューブを-80°Cで保管してください。注意: すぐにステップ3に進む場合は、チューブを-80°Cで保管する必要はありません。 2.腎臓サンプルの収集 各マウスについて、2.0 mLクライオチューブ、イソフルラン麻酔薬、コルクシート、70%エタノール、PBS付きペトリ皿、ピンセット、および外科用はさみを準備します。 マウスを1.5%イソフルランで麻酔し、1.5%に維持する。鎮痛剤(メロキシカム5 mg / kg)を皮下投与し、1.0 mLの70%エタノールを腹部に注入し、コルクシートの仰臥位に置きます。. ペダル離脱反射の消失による麻酔深度を確認する。ピンセットと外科用ハサミを使用して、腹部の皮膚を切開します。筋肉と腹膜を膀胱から肋骨の左下端まで切ります。 ピンセットを使用して腹膜を持ち上げ、外科用ハサミで腹膜の上端を横方向に切開します。肋骨の下端に沿って切開を続けます。 左腎臓を特定します。腎臓が黄白色に変わるまで血管から血液を洗い流すためにPBSでそれを再流します。最初に外科用ハサミを使用して腎臓全体を切除し、左腎動脈と静脈を切断します。腎臓をペトリ皿に入れ、PBSで慎重に洗います。注:マウスは頸部脱臼によって安楽死させられます。 ピンセットと外科用ハサミを使用して、腎臓を10 mgのサンプルにカットします(10 mgは次のステップに適したサンプルサイズです)。腎臓の各サンプルを独自の2.0 mLクライオチューブに入れます。チューブのキャップを閉じます。 長期保存の場合は、各クライオチューブを液体窒素に移し、-80°Cで保存します。 3. 血清サンプルからの全RNA抽出 最初に次の項目を準備します:ボルテックスミキサー、フェノール/グアニジンベースの溶解試薬、80%エタノール、100%エタノール、100%クロロホルム、生体高分子スピンカラム(2.0 mL収集チューブ11内)、メンブレンアンカースピンカラム(2.0 mL収集チューブ11内)、洗浄バッファー#1(すなわち、グアニジンと100%エタノールを1:2の比率で含む洗浄バッファー)、洗浄バッファー#2(すなわち、 グアニジンと100%エタノールを1:4の比率で含む洗浄バッファー)、RNaseフリー水、1.5 mLマイクロ遠心チューブ、および2.0 mLマイクロ遠心チューブ。 まず、1.5 mLの微量遠心チューブに200 μLの血清サンプルを採取し、次に1,000 μLのフェノール/グアニジンベースの溶解試薬を加えます。混合物を5秒間ボルテックスします。 サンプルをRTで5分間インキュベートします。 チューブ内の血清サンプルに200 μLのクロロホルムを加え、チューブキャップをしっかりと閉じます。チューブを15倍反転させて、クロロホルムと血清サンプルを混合します。 各サンプルをRTで3分間インキュベートします。次に、サンプルを4°Cで12,000 x gで15分間回転させます。 ペレットを乱すことなく、300 μLの上清を新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。450 μLの100%エタノールを加え、チューブを5秒間ボルテックスします。注:以下のすべてのステップで、RNAとDNAを分離するためのメンブレンアンカースピンカラムを2.0 mLの収集チューブに入れて遠心分離します。 次に、700 μLのサンプルを取り出し、メンブレンアンカースピンカラムにロードして、キャップを閉じます。カラムをRTで8,000 × gで15秒間回転させ 、 上清をカラムに残します。収集チューブに残っているペレットを廃棄します。 血清/プラズマキットの一部である700 μLの洗浄バッファー#1( 材料表を参照)をメンブレンアンカースピンカラムに追加して、サンプルを完全に洗浄します。カラムキャップを閉じ、カラムを8,000 × gで15秒間RTで回転させ 、 上清をカラムに残します。収集チューブに残っているペレットを廃棄します。 微量塩を除去するには、500 μLの洗浄バッファー#2を取り、メンブレンアンカースピンカラムにロードします。カラムキャップを閉じた後、カラムをRTで8,000 × gで15秒間回転させ 、 上清をカラムに残します。 ペレットを収集チューブに廃棄します。 微量塩を除去するには、500 μLの80%エタノールを取り、膜固定スピンカラムにロードします。カラムキャップを閉じた後、カラムをRTで8,000 × gで15秒間回転させ 、 上清をカラムに残します。 ペレットを収集チューブに廃棄します。 メンブレンアンカースピンカラムを再びRTで15,000 × gで5分間スピンします。 メンブレンアンカースピンカラムを新しい1.5 mL収集チューブに移した後、14 μLのRNaseフリー水をカラムに加え、全RNAを溶解します。カラムキャップを閉じた後、チューブをRTに残した状態で5分間待ちます。 RTで15,000 × g でカラムを再度1分間回転させます。 使用前にサンプルと一緒にチューブを-80°Cで保管してください。 4.腎臓サンプルからの総RNAの抽出 シリコンホモジナイザー、氷、ボルテックスミキサー、エタノール100%、クロロホルム100%、生体高分子スピンカラム(2.0 mL収集チューブ11)、メンブレンアンカースピンカラム(2.0 mL収集チューブ11)、フェノール/グアニジン系溶解試薬、洗浄バッファー#1(ステップ3.1と同じバッファー)、洗浄バッファー#2(ステップ3.1と同じバッファー) RNaseフリー水、1.5 mL マイクロ遠心チューブ、および 2.0 mL マイクロ遠心チューブ。 10 mgの腎臓サンプルをシリコンホモジナイザーに入れ、700 μLのフェノール/グアニジンベースの溶解試薬を加えます。 ホモジナイザーをセットアップします。ホモジナイザーの乳棒を腎臓サンプルにそっと押し付けてひねり、サンプルを均質化します。腎臓サンプルがフェノール/グアニジンベースの溶解試薬で完全に均質になるまで、乳棒を押したりひねったりし続けます。 さらに均質化するには、均質化したライセート(2.0 mL収集チューブ内)を取り、バイオポリマースピンカラムに移します。 ホモジナイズしたライセートをRTで14,000 × g で3分間遠心分離し、沈殿したペレット全体を未使用の1.5 mLマイクロ遠心チューブに移して沈殿したペレットを反転させます。 ペレットをチューブ内の140μLのクロロホルムと混合します。次に、チューブキャップをしっかりと閉じます。チューブを15倍反転させて、ライセートとクロロホルムを混合します。注意: クロロホルムはフードなしで安全に使用できます。 サンプルをRTで2〜3分間インキュベートします。サンプルを4°Cで12,000 × gで15分間遠心分離します。 沈殿物を乱すことなく、上清(通常は~300 μL)を新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。100%エタノールの1.5倍の容量(通常は~450μL)を追加します。混合物を5秒間ボルテックスします。注:以下のすべてのステップで、RNAとDNAを分離するためのメンブレンアンカースピンカラムを2.0 mLの収集チューブに入れて遠心分離します。 700 μLのサンプルをメンブレンアンカースピンカラムの1つにロードします。キャップを閉じ、カラムを15,000 × g で15秒間遠心分離します。収集チューブに残っている沈殿したライセートを廃棄します。 700 μLの洗浄バッファー#1をスピンカラムに加え、完全に洗浄します。キャップを閉じ、カラムを15,000 × g で15秒間遠心分離します。収集チューブに残っている沈殿したライセートを廃棄します。 微量の塩を除去するには、500 μLの洗浄バッファー#2をメンブレンアンカースピンカラムにロードします。カラムキャップを閉じた後、カラムを15,000 × g で15秒間遠心分離します。沈殿したライセートを回収チューブに捨てます。 手順 4.11 を繰り返します。 メンブレンアンカースピンカラムを15,000 × gで1分間遠心分離します。沈殿したライセートを回収チューブに捨てます。 メンブレンアンカースピンカラムを取り、新しい1.5 mL収集チューブに移します。30 μLのRNaseフリー水をカラムに加え、全RNAを溶解します。カラムのキャップを閉じた後、チューブをRTにして5分間待ってから、15,000 × gで1分間遠心分離します。 総RNAを含むサンプルの全量を新しいマイクロ遠心チューブに移します。チューブを氷上に置き、分光光度法により総RNA濃度を測定します。総RNA濃度が~300-1,500 ng/μLであることを確認してください。 サンプルの入ったチューブは、使用前に-80°Cで保管してください。 5. 血清中の全RNAの逆転写によるcDNAの合成 注:定量的リアルタイムPCR実験(MIQE)ガイドラインの公開に関する最小限の情報は、信頼できる明確な結果を得るために、より良い実験方法を使用することを推奨しています17。このプロトコルでは、cDNAは、逆転写酵素、ポリ(A)ポリメラーゼ、およびoligo-dTプライマーを使用して2段階の手順で精製された全RNAから合成されます。 最初に次のものを準備します:ボルテックスミキサー、サーマルサイクラー、8ウェルストリップチューブ、各8ストリップチューブのキャップ、蒸留水、氷、溶融状態の逆転写酵素キット(材料表を参照)13,14、および1.5 mLマイクロ遠心チューブ。 サーマルサイクラーを起動します。 マスターミックス溶液を調製します。8ウェルストリップチューブあたり合計8.0 μLのマスターミックスを得るには、1.5 mLマイクロ遠心チューブに2.0 μLの逆転写酵素ミックス(キットに含まれています)と2.0 μLの10x核酸ミックスを4.0 μLの逆転写バッファーに加えます。 8.0 μLのマスターミックス溶液を8ウェルストリップチューブの各チューブに入れます。 8ウェルストリップチューブの各チューブに12 μLの総RNAアリコートを入れ、チューブのキャップを閉じます。チューブをRTで15秒間、2,000 × gで遠心分離します。 チューブをサーマルサイクラーに入れ、37°Cで60分間インキュベートします。 サンプルを95°Cでさらに5分間インキュベートし、cDNAを合成します。 インキュベーション後、cDNAを新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。cDNAを蒸留水で10倍(1:10)に希釈します。チューブをRTで5秒間、2,000 × gでボルテックスして遠心分離します。 希釈したcDNAを一時的に氷上に保存します。希釈したサンプルは、使用前に-80°Cで保存してください。 6. 腎臓における全RNAの逆転写によるcDNAの合成 注:MIQEガイドラインは、信頼性が高く明確な結果を保証するために、より良い実験慣行を奨励しています17。このプロトコルは、逆転写酵素、ポリ(A)ポリメラーゼ、およびオリゴdTプライマーを使用して、1.0 μgの精製トータルRNAから2段階の手順でcDNAを合成します。 まず、ボルテックスミキサー、サーマルサイクラー、1.5 mLマイクロ遠心チューブ、8ウェルストリップチューブ、各8ストリップチューブのキャップ、蒸留水、氷、および逆転写酵素キット(材料表を参照)を準備します13,14溶融状態。 サーマルサイクラーを起動します。 マスターミックス溶液を調製します。チューブあたり合計8.0 μLのマスターミックス溶液を得るには、キットに含まれている逆転写酵素ミックス2.0 μLと10x核酸ミックス2.0 μLを4.0 μLの逆転写バッファーに加えます。 8.0 μLのマスターミックス溶液を8ウェルストリップチューブの各チューブに加えます。 総RNA密度を以下のように調整する。腎臓サンプルから1.0 μgのトータルRNAを12 μLのRNaseフリー水で分離するには、適量のトータルRNAを取り、上記のように測定された濃度を使用して蒸留水に移します(ステップ4.15)。注:DNA汚染の存在下では、汚染されたDNAはqRT-PCRによって共増幅されます。 上記の手順5.5.-5.8で説明したのと同じプロセスを実行します。 7. マイクロRNAのqRT-PCR 注:miRNAのqRT-PCRにはインターカレーター法が使用されます。プライマーはRNAに使用されます:U6小核2(RNU6-2)、miRNA-223-3p、miRNA-423-5p、miRNA-7218-5p、およびmiRNA-7219-5p。 ボルテックスミキサー、リアルタイムPCRシステム、qRT-PCR用の96ウェル反応プレート、96ウェル反応プレート用接着フィルム、接着フィルムアプリケーター、96ウェル遠心分離機ローター、miRNA特異的プライマー、2x PCRマスターミックスおよび10xユニバーサルプライマーを含む緑色色素ベースのPCRキット(材料表を参照)13,14、 1.5mLの微量遠心チューブ。 1.5 mLの微量遠心チューブで混合した後、蒸留水6.25 μL、ヌクレアーゼフリー水に溶解した5 μM miRNAプライマー各1.25 μL、2x PCRマスターミックス12.5 μL、10xユニバーサルプライマー2.5 μLをボルテックスします。 ステップ5(血清)またはステップ6(腎臓)に記載のように合成されたcDNAを調製し、融解する。cDNAをボルテックスして5秒間遠心分離します。 22.5 μLの試薬アリコート(上記のステップ7.2を参照)を取り、96ウェルプレートの各ウェルに別々に配置します。 プレートの各ウェルに2.5 μLのcDNAアリコートを追加します。 粘着フィルムをプレートに固定するには、粘着フィルムアプリケーターを使用します。プレートを96ウェル遠心分離機ローターで1,000 x g で30秒間遠心分離します。各ウェルの底で反応を安定させます。 8.リアルタイムPCRシステムとソフトウェアを使用してPCRサイクリングプログラムを実行する リアルタイム PCR システムを開始します。手順7.6の説明に従って作成したプレートを配置します。リアルタイムPCRシステムで。設定を変更します。実験の名前を入力し、システムの実験タイプとして 96ウェル(0.2 mL)、 定量方法として 比較CT(ΔΔCT)、 システム実行モードとして 標準 、およびターゲット配列を検出するための試薬として SYBR Green Reagents を選択します。 サンプルとターゲット miRNA の名前を指定し、各ウェルのサンプルとターゲット miRNA に名前を付けます。重複サンプルを割り当てて結果の確認に適したデータを取得し、参照サンプルと内在性コントロールを選択します。パッシブリファレンスとして使用する染料については、「 なし」を選択します。試薬のクロスコンタミネーションを排除するには、陰性の逆転写酵素とmiRNA発現の非テンプレートコントロールを設定します。 次に、反応量が 20 μL に設定され、PCRサイクル条件が次のように設定されていることを確認します:95°Cで15分間、次に94°Cで15秒間40サイクルの変性、55°Cで30秒間アニーリング、最後に70°Cで30秒間伸長します。 システムのソフトウェアプログラムで[分析]をクリックして、プロセス完了後にqRT-PCRデータを 分析 します。プログラムによって自動的に選択された閾値線が各ウェルに適していることを確認します。 各サンプルで分析された内在性コントロールおよび標的miRNAの閾値サイクル(CT)値を確認します。増幅曲線と閾値線の交点によってCT値を決定する。注:本研究では、RNU6-2およびmiRNA-423-5pを標的miRNA発現量の内在性コントロールとして使用し、ΔΔCT法を使用して各標的miRNA18の相対発現レベルを決定しました。