Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie evaluatie van microRNA-expressie in nier en serum van muizen met leeftijdsafhankelijke nierinsufficiëntie

Het experimentele protocol werd goedgekeurd door de Commissie Voor Dierethiek van de Jichi Medical University en uitgevoerd in overeenstemming met de Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals en de richtlijnen met betrekking tot het gebruik en de verzorging van proefdieren. Dit protocol maakt gebruik van vier 50 weken oude SAMR1 mannelijke muizen en SAMP1 mannelijke muizen (40-45 g). 1. Verzameling van serummonsters Bereid het volgende voor elke muis: 30 G naalden met een spuit van 1,0 ml, een 1,0 ml spitscentrifugatiebuis met heparine, 1,5 ml microcentrifugebuizen, isofluraan-anestheticum, een kurkvel, 70% ethanol, twee wattenstaafjes bevochtigd met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), een petrischaal met PBS, pincet en chirurgische schaar. Verdoof de muis met 1,5% isofluraan en handhaaf op 1,5%. Dien een pijnstillend middel (Meloxicam 5 mg/kg) subcutaan toe, injecteer vervolgens 1,0 ml 70% ethanol in de buik en plaats het in rugligging op het kurkvel. Bevestig de diepte van de anesthesie door het verdwijnen van de pedaalonttrekkingsreflex. Met het pincet en de chirurgische schaar, snijd de huid van de buik. Snijd de spieren en het peritoneale membraan van de blaas naar de linkeronderrand van de ribben. Gebruik het pincet om het peritoneale membraan op te tillen en maak een laterale incisie in de bovenrand van het peritoneale membraan met de chirurgische schaar. Vervolg de incisie langs de onderste rand van de ribben. Identificeer de inferieure vena cava met behulp van de twee PBS-bevochtigde wattenstaafjes. Steek een van de naalden van 30 G met de spuit van 1,0 ml in de inferieure vena cava en trek vervolgens aan de spuit. Trek de naald langzaam uit de inferieure vena cava om hemolyse te voorkomen. Breng het bloed over naar de 1,0 ml spitsbuis met heparine en meng het vervolgens door de buis meerdere keren om te keren.OPMERKING: De muis wordt geëuthanaseerd door cervicale dislocatie. Draai de spitsbuis bij kamertemperatuur (RT), 3.000 × g gedurende 10 minuten. Adem het supernatant langzaam aan, zorg ervoor dat het geen sediment bevat en breng het vervolgens over naar een ongebruikte microcentrifugebuis van 1,5 ml. Bewaar de buis voor gebruik bij −80 °C.OPMERKING: Als u onmiddellijk naar stap 3 gaat, hoeft de buis niet bij −80 °C te worden bewaard. 2. Verzameling van niermonsters Bereid het volgende voor elke muis: 2,0 ml cryobuizen, isofluraan-anestheticum, een kurkvel, 70% ethanol, een petrischaal met PBS, pincet en chirurgische schaar. Verdoof de muis met 1,5% isofluraan en handhaaf op 1,5%. Dien een pijnstillend middel (Meloxicam 5 mg/kg) subcutaan toe, injecteer vervolgens 1,0 ml 70% ethanol in de buik en plaats het in rugligging op het kurkvel. Bevestig de diepte van de anesthesie door het verdwijnen van de pedaalonttrekkingsreflex. Gebruik het pincet en de chirurgische schaar om een incisie in de buikhuid te maken. Snijd de spieren en het peritoneale membraan van de blaas naar de linkeronderrand van de ribben. Gebruik het pincet om het peritoneale membraan op te tillen en maak een laterale incisie in de bovenrand van het peritoneale membraan met de chirurgische schaar. Vervolg de incisie langs de onderste rand van de ribben. Identificeer de linker nier. Reflux het met PBS om het bloed uit de bloedvaten te spoelen totdat de nier een geelachtig witte kleur krijgt. Snijd eerst de hele nier af met behulp van een chirurgische schaar om de linker nierslagader en ader door te snijden. Plaats de nier in een petrischaaltje en was deze zorgvuldig met PBS.OPMERKING: De muis wordt geëuthanaseerd door cervicale dislocatie. Gebruik het pincet en de chirurgische schaar om de nier in monsters van 10 mg te snijden (10 mg is een geschikte steekproefgrootte voor de volgende stap). Plaats elk monster van de nier in zijn eigen cryobuis van 2,0 ml. Sluit de dop van de buis. Breng voor langdurige opslag elke cryobuis over in vloeibare stikstof en bewaar deze bij −80 °C. 3. Totale RNA-extractie uit een serummonster Bereid eerst de volgende items voor: een vortexmixer, op fenol/guanidine gebaseerde lysisreagens, 80% ethanol, 100% ethanol, 100% chloroform, biopolymeerspinkolommen (in verzamelbuizen van 2,0 ml11), membraanverankerde spinkolommen (in verzamelbuizen van 2,0 ml11), wasbuffer #1 (d.w.z. wasbuffer met guanidine en 100% ethanol in een verhouding van 1:2), wasbuffer #2 (d.w.z. wasbuffer met guanidine en 100% ethanol in een verhouding van 1:4), RNase-vrij water, 1,5 ml microcentrifugebuizen en 2,0 ml microcentrifugebuizen. Neem eerst een serummonster van 200 μL in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en voeg vervolgens 1.000 μL van het op fenol/guanidine gebaseerde lysisreagens toe. Vortex het mengsel gedurende 5 s. Incubeer het monster bij RT gedurende 5 min. Voeg 200 μL chloroform toe aan het serummonster in de buis en sluit de buisdop goed af. Keer de buis 15x om om de chloroform en het serummonster te mengen. Elk monster wordt gedurende 3 minuten geïncubeerd bij RT. Draai vervolgens het monster op 4 °C gedurende 15 minuten bij 12.000 x g. Breng de 300 μL supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml zonder de pellet te verstoren. Voeg 450 μL 100% ethanol toe en vortex de buis gedurende 5 s.OPMERKING: Plaats in alle volgende stappen de membraanverankerde spinkolom voor de scheiding van RNA en DNA in een verzamelbuis van 2,0 ml om deze te centrifugeren. Verwijder vervolgens 700 μL van het monster, laad het op een membraanverankerde spinkolom en sluit de dop. Draai de kolom op RT gedurende 15 s bij 8.000 × g en laat het supernatant in de kolom staan. Gooi de pellet die achterblijft in de opvangbuis weg. Voeg 700 μL wasbuffer #1 toe die deel uitmaakt van de serum/plasmakit (zie de materiaaltabel) aan de membraanverankerde spinkolom om het monster grondig te reinigen. Sluit de kolomdop en draai de kolom op RT gedurende 15 s bij 8.000 × g en laat het supernatant in de kolom staan. Gooi de pellet die achterblijft in de opvangbuis weg. Neem voor het verwijderen van sporenzouten 500 μL wasbuffer #2 en laad deze op een membraanverankerde spinkolom. Nadat u de kolomdop hebt gesloten, draait u de kolom gedurende 15 s op RT bij 8.000 × g en laat u het supernatant in de kolom staan. Gooi de pellet weg in de opvangbuis. Neem voor het verwijderen van sporenzouten 500 μL 80% ethanol en laad het op een membraanverankerde spinkolom. Nadat u de kolomdop hebt gesloten, draait u de kolom gedurende 15 s op RT bij 8.000 × g en laat u het supernatant in de kolom staan. Gooi de pellet weg in de opvangbuis. Draai de membraanverankerde spinkolom opnieuw op RT gedurende 5 minuten bij 15.000 × g. Nadat u de membraanverankerde spinkolom hebt overgebracht naar een nieuwe verzamelbuis van 1,5 ml, voegt u 14 μL RNase-vrij water toe aan de kolom om het totale RNA op te lossen. Wacht na het sluiten van de kolomdop 5 minuten met de buis links op RT. Draai de kolom opnieuw gedurende 1 minuut bij 15.000 × g bij RT. Bewaar de tubes met monsters bij −80 °C voor gebruik. 4. Extractie van totaal RNA uit een niermonster Bereid eerst de volgende items voor: een siliciumhomogenisator, ijs, een vortexmixer, 100% ethanol, 100% chloroform, biopolymeerspinkolommen (in 2,0 ml verzamelbuizen11), membraanverankerde spinkolommen (in 2,0 ml verzamelbuizen11), fenol / guanidine-gebaseerd lysisreagens, wasbuffer # 1 (dezelfde buffer als stap 3.1.), wasbuffer # 2 (dezelfde buffer als stap 3.1.), RNase-vrij water, 1,5 ml microcentrifugebuizen en 2,0 ml microcentrifugebuizen. Plaats een niermonster van 10 mg in de siliciumhomogenisator en voeg 700 μL van het op fenol/guanidine gebaseerde lysisreagens toe. Stel de homogenisator in. Druk zachtjes op de stamper van de homogenisator tegen het niermonster om het monster te homogeniseren. Blijf op de stamper drukken en draaien totdat het niermonster volledig is gehomogeniseerd in het op fenol/guanidine gebaseerde lysisreagens. Neem voor verdere homogenisatie het gehomogeniseerde lysaat (in een verzamelbuis van 2,0 ml) en breng het over naar een biopolymeerspinkolom. Centrifugeer het gehomogeniseerde lysaat bij RT gedurende 3 minuten bij 14.000 × g en breng vervolgens de volledige neergeslagen pellet over naar een ongebruikte microcentrifugebuis van 1,5 ml om de neergeslagen pellet om te keren Meng de pellet met 140 μL chloroform in de buis; sluit vervolgens de buisdop goed. Keer de buis 15x om om het lysaat en chloroform te mengen.OPMERKING: De chloroform kan veilig worden gebruikt zonder kap. Incubeer het monster bij RT gedurende 2-3 minuten. Centrifugeer het monster bij 4 °C gedurende 15 minuten bij 12.000 × g. Breng het supernatant (dat meestal ~ 300 μL is) over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml, zonder het neerslag te verstoren. Voeg 1,5 keer het volume (dat meestal ~ 450 μL is) 100% ethanol toe. Vortex het mengsel gedurende 5 s.OPMERKING: Plaats in alle volgende stappen de membraanverankerde spinkolom voor het scheiden van RNA en DNA in een verzamelbuis van 2,0 ml om deze te centrifugeren. Laad 700 μL monster op een van de membraanverankerde spinkolommen. Sluit de dop en centrifugeer de kolom op 15.000 × g gedurende 15 s. Gooi het neergeslagen lysaat dat achterblijft in de opvangbuis weg. Voeg 700 μL wasbuffer #1 toe aan de spinkolom om deze grondig te wassen. Sluit de dop en centrifugeer de kolom op 15.000 × g gedurende 15 s. Gooi het neergeslagen lysaat dat achterblijft in de opvangbuis weg. Voor het verwijderen van sporenhoeveelheden zout laadt u 500 μL wasbuffer #2 op de membraanverankerde spinkolom. Na het sluiten van de kolomdop, centrifugeert u de kolom op 15.000 × g gedurende 15 s. Gooi het neergeslagen lysaat in de opvangbuis weg. Herhaal stap 4.11. Centrifugeer de membraanverankerde spinkolom opnieuw gedurende 1 minuut bij 15.000 × g. Gooi het neergeslagen lysaat in de opvangbuis weg. Neem de membraanverankerde spinkolom en breng deze over naar een nieuwe 1,5 ml verzamelbuis. Voeg 30 μL RNase-vrij water toe aan de kolom om het totale RNA op te lossen. Wacht na het sluiten van de dop van de kolom 5 minuten met de buis op RT en centrifugeer de kolom vervolgens gedurende 1 minuut bij 15.000 × g. Breng het totale volume van het monster dat totaal RNA bevat over naar een nieuwe microcentrifugebuis. Plaats de buis op ijs en meet de totale RNA-concentratie met behulp van spectrofotometrie. Zorg ervoor dat de totale RNA-concentratie ~300-1.500 ng/μL is. Bewaar buizen met monsters bij −80 °C voor gebruik. 5. Synthese van cDNA met de reverse transcriptie van totaal RNA in serum OPMERKING: De minimale informatie voor de publicatie van kwantitatieve real-time PCR-experimenten (MIQE) -richtlijnen beveelt aan betere experimentele praktijken te gebruiken om betrouwbare, ondubbelzinnige resultaten te verkrijgen17. In dit protocol wordt cDNA gesynthetiseerd uit het totale RNA gezuiverd in een tweestapsprocedure met behulp van reverse transcriptase, poly (A) polymerase en oligo-dT primers. Bereid eerst het volgende voor: een vortexmixer, een thermische cycler, achtputtenstripbuizen, de dop van elke achtstripbuis, gedestilleerd water, ijs, de reverse transcriptasekit (zie de materiaaltabel)13,14 in gesmolten toestand en 1,5 ml microcentrifugebuizen. Start de thermische cycler. Bereid de mastermixoplossing voor; om in totaal 8,0 μL mastermix per achtputten stripbuis te verkrijgen, voegt u 2,0 μL reverse transcriptasemix (inbegrepen in de kit) en 2,0 μL 10x nucleïnezuurmengsel toe aan 4,0 μL reverse-transcriptiebuffer in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Breng 8,0 μL van de hoofdmengseloplossing in elke buis van een achtputtens stripbuis. Plaats een aliquot van 12 μL totaal RNA in elke buis van de acht-wells stripbuis en sluit de dop van de buis. Centrifugeer de buis gedurende 15 s bij RT en 2.000 × g. Plaats de buis in de thermische cycler en incubeer gedurende 60 minuten bij 37 °C. Incubeer het monster gedurende nog eens 5 minuten bij 95 °C min om het cDNA te synthetiseren. Breng na de incubatie het cDNA over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml. Verdun de cDNA tienvoudig (1:10) met gedestilleerd water. Vortex en centrifugeer de buis gedurende 5 s bij RT en 2.000 × g. Bewaar de verdunde cDNA tijdelijk op ijs. Bewaar de verdunde monsters voor gebruik bij −80 °C. 6. Synthese van cDNA met de reverse transcriptie van totaal RNA in de nier OPMERKING: De MIQE-richtlijnen moedigen betere experimentele praktijken aan om betrouwbare en ondubbelzinnige resultaten te garanderen17. Dit protocol maakt gebruik van reverse transcriptase, poly(A)polymerase en oligo dT primers om cDNA te synthetiseren uit 1,0 μg gezuiverd totaal RNA in een procedure in twee stappen. Bereid eerst het volgende voor: een vortexmixer, een thermische cycler, 1,5 ml microcentrifugebuizen, achtputtenstripbuizen, de dop van elke achtstripbuis, gedestilleerd water, ijs en een reverse transcriptasekit (zie de tabel met materialen)13,14 in gesmolten toestand. Start de thermische cycler. Bereid de mastermixoplossing voor; om in totaal 8,0 μL mastermixoplossing per buis te verkrijgen, voegt u 2,0 μL van het reverse transcriptasemengsel toe dat in de kit is opgenomen en 2,0 μL 10x nucleïnezuurmengsel aan 4,0 μL van de reverse-transcriptiebuffer. Voeg 8,0 μL van de hoofdmengseloplossing toe aan elke buis van een stripbuis met acht putten. Pas de totale RNA-dichtheid als volgt aan. Neem voor de scheiding van 1,0 μg totaal RNA uit een niermonster met 12 μL RNase-vrij water een geschikte hoeveelheid totaal RNA en breng dit over naar gedestilleerd water met behulp van de concentratie gemeten zoals hierboven beschreven (in stap 4.15.).OPMERKING: In aanwezigheid van DNA-besmetting wordt het besmette DNA mede versterkt door qRT-PCR. Voer hetzelfde proces uit als hierboven beschreven in stap 5.5.-5.8. 7. De qRT-PCR van miRNA OPMERKING: Een intercalatormethode wordt gebruikt voor de qRT-PCR van de miRNA’s. Primers worden gebruikt voor RNA: U6 small nuclear 2 (RNU6-2), miRNA-223-3p, miRNA-423-5p, miRNA-7218-5p en miRNA-7219-5p. Bereid het volgende voor: een vortexmixer, een real-time PCR-systeem, een 96-well reactieplaat voor qRT-PCR, zelfklevende film voor de 96-well reactieplaat, zelfklevende filmapplicator, een 96-well centrifuge rotor, miRNA-specifieke primers, een op groene kleurstof gebaseerde PCR-kit met 2x PCR-mastermix en 10x universele primer (zie de Materiaaltabel)13,14, en een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Vortex het volgende na het mengen in een 1,5 ml microcentrifugebuis: 6,25 μL gedestilleerd water, 1,25 μL elk van 5 μM miRNA primer opgelost in nucleasevrij water, 12,5 μL 2x PCR-mastermix en 2,5 μL 10x universele primer. Bereid en smelt het cDNA gesynthetiseerd zoals beschreven in stap 5 (serum) of stap 6 (nier). Vortex en centrifugeer de cDNA gedurende 5 s. Neem 22,5 μL aliquots van het reagens (zoals beschreven in stap 7.2. hierboven) en plaats ze afzonderlijk in elk putje van de 96-well plaat. Voeg een aliquot cDNA van 2,5 μL toe aan elk putje van de plaat. Om de zelfklevende film aan de plaat te bevestigen, gebruikt u de zelfklevende filmapplicator. Centrifugeer de plaat gedurende 30 s bij 1.000 x g in de 96-well centrifuge rotor. Stabiliseer de reactie op de bodem van elke put. 8. Het real-time PCR-systeem en de software gebruiken om het PCR-fietsprogramma uit te voeren Begin met het real-time PCR-systeem. Plaats de plaat die is gemaakt zoals beschreven in stap 7.6. in het real-time PCR-systeem. Wijzig de instellingen; geef een naam op voor het experiment en selecteer vervolgens 96-well (0,2 ml) als het experimenttype van het systeem, Vergelijkende CT (ΔΔCT) als de kwantificeringsmethode, standaard als de systeemrunmodus en SYBR Green Reagentia als de reagentia voor het detecteren van de doelsequentie. Geef namen op voor het monster en de miRNA’s van het doel en geef het monster een naam en het doel-miRNA in elke put. Wijs dubbele monsters toe om gegevens te verkrijgen die geschikt zijn om de resultaten te bevestigen, en kies een referentiemonster en de endogene controle. Als u de kleurstof als passieve referentie wilt gebruiken, selecteert u geen kleurstof. Om reagenskruisbesmetting te elimineren, stelt u negatieve reverse transcriptase en een niet-sjablooncontrole voor miRNA-expressie in. Zorg er vervolgens voor dat het reactievolume is ingesteld op 20 μL en dat de PCR-cyclusomstandigheden als volgt zijn ingesteld: 95 °C gedurende 15 minuten, vervolgens 40 cycli van denaturatie bij 94 °C gedurende 15 s, gloeien bij 55 °C gedurende 30 s en ten slotte verlenging bij 70 °C gedurende 30 s. Klik op analyseren in het softwareprogramma van het systeem om de qRT-PCR-gegevens te analyseren nadat het proces is voltooid. Controleer of de drempellijn die automatisch door het programma is geselecteerd, geschikt is voor elke put. Controleer de drempelwaarde (CT) waarde van de endogene controle en doel miRNA’s geanalyseerd in elk monster. Bepaal de CT-waarden door het snijpunt van de versterkingscurve en de drempellijn.OPMERKING: In deze studie werden RNU6-2 en miRNA-423-5p gebruikt als de endogene controles voor miRNA-expressieniveaus van doelen, en de ΔΔCT-methode werd gebruikt om de relatieve expressieniveaus van elk doel-miRNA18 te bepalen.