Valutazione quantitativa della reazione a catena della polimerasi in tempo reale dell'espressione di microRNA nel rene e nel siero di topi con compromissione renale dipendente dall'età

Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato etico animale della Jichi Medical University ed eseguito in conformità con la Guida della Jichi Medical University per gli animali da laboratorio e le sue linee guida riguardanti l’uso e la cura degli animali da esperimento. Questo protocollo utilizza quattro topi maschi SAMR1 di 50 settimane e topi maschi SAMP1 (40-45 g). 1. Raccolta di campioni di siero Preparare quanto segue per ogni topo: aghi da 30 G con una siringa da 1,0 ml, un tubo di centrifugazione spitz da 1,0 ml con eparina, tubi da microcentrifuga da 1,5 ml, anestetico isoflurano, un foglio di sughero, etanolo al 70%, due tamponi di cotone inumiditi con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), una capsula di Petri con PBS, pinzette e forbici chirurgiche. Anestetizzare il topo con isoflurano all’1,5% e mantenerlo all’1,5%. Somministrare un analgesico (Meloxicam 5 mg/kg) per via sottocutanea, quindi iniettare 1,0 ml di etanolo al 70% nell’addome e posizionarlo in posizione supina sul foglio di sughero. Confermare la profondità dell’anestesia dalla scomparsa del riflesso di ritiro del pedale. Con le pinzette e le forbici chirurgiche, incidere la pelle dell’addome. Tagliare i muscoli e la membrana peritoneale dalla vescica al bordo inferiore sinistro delle costole. Utilizzare le pinzette per sollevare la membrana peritoneale e fare un’incisione laterale nel bordo superiore della membrana peritoneale con le forbici chirurgiche. Continuare l’incisione lungo il bordo più basso delle costole. Identificare la vena cava inferiore utilizzando i due tamponi di cotone inumiditi con PBS. Inserire uno degli aghi da 30 G con la siringa da 1,0 mL nella vena cava inferiore e quindi tirare la siringa. Tirare lentamente l’ago dalla vena cava inferiore per evitare l’emolisi. Trasferire il sangue al tubo spitz da 1,0 mL con eparina e quindi mescolarlo invertendo il tubo più volte.NOTA: Il topo viene sottoposto a eutanasia per lussazione cervicale. Girare il tubo spitz a temperatura ambiente (RT), 3.000 × g per 10 min. Aspirare lentamente il surnatante e assicurarsi che non contenga sedimenti, quindi trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml inutilizzata. Conservare il tubo a -80 °C prima dell’uso.NOTA: se si procede immediatamente al punto 3, non è necessario conservare il tubo a -80 °C. 2. Raccolta di campioni di rene Preparare quanto segue per ogni topo: criotubi da 2,0 ml, anestetico isoflurano, un foglio di sughero, etanolo al 70%, una capsula di Petri con PBS, pinzette e forbici chirurgiche. Anestetizzare il topo con isoflurano all’1,5% e mantenerlo all’1,5%. Somministrare un analgesico (Meloxicam 5 mg/kg) per via sottocutanea, quindi iniettare 1,0 ml di etanolo al 70% nell’addome e posizionarlo in posizione supina sul foglio di sughero. Confermare la profondità dell’anestesia dalla scomparsa del riflesso di ritiro del pedale. Utilizzare le pinzette e le forbici chirurgiche per fare un’incisione nella pelle addominale. Tagliare i muscoli e la membrana peritoneale dalla vescica al bordo inferiore sinistro delle costole. Utilizzare le pinzette per sollevare la membrana peritoneale e fare un’incisione laterale nel bordo superiore della membrana peritoneale con le forbici chirurgiche. Continuare l’incisione lungo il bordo più basso delle costole. Identificare il rene sinistro. Reflusso con PBS per lavare il sangue dai vasi fino a quando il rene diventa di un colore bianco-giallastro. Asportare l’intero rene prima usando le forbici chirurgiche per recidere l’arteria renale sinistra e la vena. Posizionare il rene in una capsula di Petri e lavarlo accuratamente con PBS.NOTA: Il topo viene sottoposto a eutanasia per lussazione cervicale. Utilizzare le pinzette e le forbici chirurgiche per tagliare il rene in campioni da 10 mg (10 mg è una dimensione del campione adatta per la fase successiva). Posizionare ogni campione di rene nel proprio criotubo da 2,0 ml. Chiudere il tappo del tubo. Per la conservazione a lungo termine, trasferire ogni criotubo in azoto liquido e conservarlo a -80 °C. 3. Estrazione totale dell’RNA da un campione di siero Preparare prima i seguenti elementi: un miscelatore a vortice, reagente di lisi a base di fenolo/guanidina, etanolo all’80%, etanolo al 100%, cloroformio al 100%, colonne di spin in biopolimero (in provette di raccolta 11 da 2,0 ml), colonne di spin ancorate a membrana (in provette di raccolta da 2,0 ml11), tampone di lavaggio #1 (cioè tampone di lavaggio contenente guanidina e etanolo al100% in un rapporto di 1:2), tampone di lavaggio #2 (cioè tampone di lavaggio contenente guanidina ed etanolo al 100% in un rapporto di 1:4), acqua priva di RNasi, provette per microcentrifuga da 1,5 ml e provette per microcentrifuga da 2,0 ml. In primo luogo, prelevare un campione di siero da 200 μL in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml, quindi aggiungere 1.000 μL del reagente di lisi a base di fenolo/guanidina. Vortice la miscela per 5 s. Incubare il campione a RT per 5 minuti. Aggiungere 200 μL di cloroformio al campione di siero nella provetta e chiudere ermeticamente il cappuccio del tubo. Capovolgere la provetta 15x per mescolare il cloroformio e il campione di siero. Ogni campione viene incubato a RT per 3 minuti. Quindi, ruotare il campione a 4 °C per 15 minuti a 12.000 x g. Trasferire i 300 μL di surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 mL senza disturbare il pellet. Aggiungere 450 μL di etanolo al 100% e vortice il tubo per 5 s.NOTA: In tutti i passaggi successivi, posizionare la colonna di spin ancorata alla membrana per la separazione di RNA e DNA in una provetta di raccolta da 2,0 ml per centrifugarla. Quindi, rimuovere 700 μL del campione, caricarlo su una colonna di spin ancorata a membrana e chiudere il tappo. Ruotare la colonna in RT per 15 s a 8.000 × g e lasciare il surnatante nella colonna. Scartare il pellet rimasto nel tubo di raccolta. Aggiungere 700 μL di tampone di lavaggio #1 che fa parte del kit siero/plasma (vedere la tabella dei materiali) alla colonna di spin ancorata alla membrana per pulire accuratamente il campione. Chiudere il tappo della colonna e ruotare la colonna in RT per 15 s a 8.000 × g e lasciare il surnatante nella colonna. Scartare il pellet rimasto nel tubo di raccolta. Per la rimozione dei sali in tracce, prelevare 500 μL di tampone di lavaggio #2 e caricarlo su una colonna di rotazione ancorata a membrana. Dopo aver chiuso il tappo della colonna, ruotare la colonna su RT per 15 s a 8.000 × g e lasciare il surnatante nella colonna. Scartare il pellet nel tubo di raccolta. Per la rimozione dei sali in tracce, prelevare 500 μL di etanolo all’80% e caricarlo su una colonna di spin ancorata a membrana. Dopo aver chiuso il tappo della colonna, ruotare la colonna su RT per 15 s a 8.000 × g e lasciare il surnatante nella colonna. Scartare il pellet nel tubo di raccolta. Ruotare nuovamente la colonna di spin ancorata a membrana a RT per 5 minuti a 15.000 × g. Dopo aver trasferito la colonna di spin ancorata alla membrana in un nuovo tubo di raccolta da 1,5 ml, aggiungere 14 μL di acqua priva di RNasi alla colonna per dissolvere l’RNA totale. Dopo aver chiuso il tappo della colonna, attendere 5 minuti con il tubo a sinistra a RT. Ruotare nuovamente la colonna per 1 minuto a 15.000 × g a RT. Conservare le provette con campioni a -80 °C prima dell’uso. 4. Estrazione di RNA totale da un campione di rene Preparare prima i seguenti elementi: un omogeneizzatore al silicio, ghiaccio, un miscelatore a vortice, etanolo al 100%, cloroformio al 100%, colonne di spin in biopolimero (in provette di raccolta 11 da 2,0 ml), colonne di spin ancorate a membrana (in provette di raccolta11 da 2,0 ml), reagente di lisi a base di fenolo/guanidina, tampone di lavaggio #1 (lo stesso tampone del punto 3.1.), tampone di lavaggio #2 (lo stesso tampone del punto 3.1.), Acqua senza RNasi, provette per microcentrifuga da 1,5 ml e provette per microcentrifuga da 2,0 ml. Inserire un campione di rene da 10 mg nell’omogeneizzatore di silicio e aggiungere 700 μL del reagente di lisi a base di fenolo/guanidina. Impostare l’omogeneizzatore. Premere delicatamente e ruotare il pestello dell’omogeneizzatore contro il campione di rene per omogeneizzare il campione. Continuare a premere e torcere il pestello fino a quando il campione di rene è completamente omogeneizzato nel reagente di lisi a base di fenolo/guanidina. Per un’ulteriore omogeneizzazione, prendere il lisato omogeneizzato (in una provetta di raccolta da 2,0 ml) e trasferirlo su una colonna di spin biopolimerica. Centrifugare il lisato omogeneizzato a RT per 3 minuti a 14.000 × g e quindi trasferire l’intero pellet precipitato in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml inutilizzato per invertire il pellet precipitato Mescolare il pellet con 140 μL di cloroformio nel tubo; Quindi, chiudere saldamente il tappo del tubo. Capovolgere il tubo 15x per mescolare il lisato e il cloroformio.NOTA: Il cloroformio può essere utilizzato in modo sicuro senza cappuccio. Incubare il campione a RT per 2-3 minuti. Centrifugare il campione a 4 °C per 15 minuti a 12.000 × g. Trasferire il surnatante (che di solito è ~ 300 μL) in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 ml, senza disturbare il precipitato. Aggiungere 1,5 volte il suo volume (che di solito è ~ 450 μL) di etanolo al 100%. Vortice la miscela per 5 s.NOTA: In tutti i passaggi seguenti, posizionare la colonna di spin ancorata alla membrana per separare RNA e DNA in una provetta di raccolta da 2,0 mL per centrifugarla. Caricare 700 μL di campione su una delle colonne di spin ancorate a membrana. Chiudere il tappo e centrifugare la colonna a 15.000 × g per 15 s. Eliminare il lisato precipitato rimasto nella provetta di raccolta. Aggiungere 700 μL di tampone di lavaggio #1 alla colonna di centrifuga per lavarla accuratamente. Chiudere il tappo e centrifugare la colonna a 15.000 × g per 15 s. Eliminare il lisato precipitato rimasto nella provetta di raccolta. Per rimuovere tracce di sale, caricare 500 μL di tampone di lavaggio #2 sulla colonna di rotazione ancorata alla membrana. Dopo aver chiuso il tappo della colonna, centrifugare la colonna a 15.000 × g per 15 s. Scartare il lisato precipitato nella provetta di raccolta. Ripetere il passaggio 4.11. Centrifugare nuovamente la colonna di spin ancorata a membrana per 1 minuto a 15.000 × g. Scartare il lisato precipitato nella provetta di raccolta. Prelevare la colonna di spin ancorata a membrana e trasferirla in un nuovo tubo di raccolta da 1,5 ml. Aggiungere 30 μL di acqua priva di RNasi alla colonna per dissolvere l’RNA totale. Dopo aver chiuso il tappo della colonna, attendere 5 minuti con il tubo a RT, quindi centrifugare la colonna per 1 minuto a 15.000 × g. Trasferire il volume totale del campione contenente RNA totale in una nuova provetta per microcentrifuga. Posizionare il tubo sul ghiaccio e misurare la concentrazione totale di RNA mediante spettrofotometria. Assicurarsi che la concentrazione totale di RNA sia ~ 300-1.500 ng / μL. Conservare le provette contenenti campioni a -80 °C prima dell’uso. 5. Sintesi di cDNA con trascrizione inversa dell’RNA totale nel siero NOTA: Le informazioni minime per la pubblicazione di esperimenti quantitativi di PCR in tempo reale (MIQE) raccomandano l’uso di migliori pratiche sperimentali per ottenere risultati affidabili e inequivocabili17. In questo protocollo, il cDNA viene sintetizzato dall’RNA totale purificato in una procedura in due fasi utilizzando trascrittasi inversa, poli(A) polimerasi e primer oligo-dT. Preparare prima quanto segue: un miscelatore a vortice, un termociclatore, tubi a otto pozzetti, il tappo di ogni tubo a otto strisce, acqua distillata, ghiaccio, il kit di trascrittasi inversa (vedi la tabella dei materiali)13,14 allo stato fuso e provette di microcentrifuga da 1,5 ml. Avviare il termociclatore. Preparare la soluzione master mix; per ottenere un totale di 8,0 μL di miscela master per tubo a otto pozzetti, aggiungere 2,0 μL di miscela di trascrittasi inversa (inclusa nel kit) e 2,0 μL di miscela di acido nucleico 10x a 4,0 μL di tampone di trascrizione inversa in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Introdurre 8,0 μL della soluzione master mix in ciascuna provetta di un tubo a otto pozzetti. Posizionare un’aliquota di 12 μL di RNA totale in ciascuna provetta del tubo a otto pozzetti e chiudere il cappuccio del tubo. Centrifugare il tubo per 15 s a RT e 2.000 × g. Posizionare il tubo nel termociclatore e incubare per 60 minuti a 37 °C. Incubare il campione per altri 5 minuti a 95 °C min per sintetizzare il cDNA. Dopo l’incubazione, trasferire il cDNA in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Diluire il cDNA dieci volte (1:10) con acqua distillata. Vortice e centrifugare il tubo per 5 s a RT e 2.000 × g. Conservare temporaneamente il cDNA diluito sul ghiaccio. Conservare i campioni diluiti a -80 °C prima dell’uso. 6. Sintesi di cDNA con trascrizione inversa dell’RNA totale nel rene NOTA: Le linee guida MIQE incoraggiano migliori pratiche sperimentali per garantire risultati affidabili e inequivocabili17. Questo protocollo utilizza trascrittasi inversa, poli (A) polimerasi e primer oligo dT per sintetizzare cDNA da 1,0 μg di RNA totale purificato in una procedura in due fasi. In primo luogo, preparare quanto segue: un miscelatore a vortice, un termociclatore, tubi per microcentrifuga da 1,5 ml, tubi a nastro a otto pozzetti, il tappo di ogni tubo a otto strisce, acqua distillata, ghiaccio e un kit di trascrittasi inversa (vedi la tabella dei materiali)13,14 allo stato fuso. Avviare il termociclatore. Preparare la soluzione master mix; per ottenere un totale di 8,0 μL di soluzione master mix per provetta, aggiungere 2,0 μL della miscela di trascrittasi inversa inclusa nel kit e 2,0 μL di miscela di acido nucleico 10x a 4,0 μL del tampone di trascrizione inversa. Aggiungere 8,0 μL della soluzione master mix a ciascun tubo di un tubo a otto pozzetti. Regolare la densità totale dell’RNA come segue. Per la separazione di 1,0 μg di RNA totale da un campione di rene con 12 μL di acqua priva di RNasi, prelevare una quantità adeguata di RNA totale e trasferirla in acqua distillata utilizzando la concentrazione misurata come descritto sopra (nella fase 4.15.).NOTA: In presenza di contaminazione del DNA, il DNA contaminato viene co-amplificato mediante qRT-PCR. Eseguire lo stesso processo descritto sopra nei passaggi 5.5.-5.8. 7. La qRT-PCR dei miRNA NOTA: Un metodo intercalatore viene utilizzato per la qRT-PCR dei miRNA. I primer sono usati per l’RNA: U6 small nuclear 2 (RNU6-2), miRNA-223-3p, miRNA-423-5p, miRNA-7218-5p e miRNA-7219-5p. Preparare quanto segue: un miscelatore a vortice, un sistema di PCR in tempo reale, una piastra di reazione a 96 pozzetti per qRT-PCR, pellicola adesiva per la piastra di reazione a 96 pozzetti, applicatore di pellicola adesiva, un rotore centrifugo a 96 pozzetti, primer specifici per miRNA, un kit PCR a base di colorante verde contenente 2x PCR master mix e 10x primer universale (vedere la tabella dei materiali)13,14, e una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Vortice quanto segue dopo averli miscelati in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml: 6,25 μL di acqua distillata, 1,25 μL ciascuno di primer miRNA da 5 μM sciolto in acqua priva di nucleasi, 12,5 μL di 2x miscela master PCR e 2,5 μL di primer universale 10x. Preparare e sciogliere il cDNA sintetizzato come descritto nella fase 5 (siero) o nella fase 6 (rene). Vortice e centrifugare il cDNA per 5 s. Prelevare 22,5 μL di aliquote del reattivo (come descritto al precedente punto 7.2) e collocarle separatamente in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Aggiungere un’aliquota di 2,5 μL di cDNA a ciascun pozzetto della piastra. Per fissare la pellicola adesiva alla piastra, utilizzare l’applicatore di pellicola adesiva. Centrifugare la piastra per 30 s a 1.000 x g nel rotore della centrifuga a 96 pozzetti. Stabilizzare la reazione sul fondo di ciascun pozzetto. 8. Utilizzo del sistema e del software di PCR in tempo reale per eseguire il programma di ciclismo PCR Iniziare il sistema di PCR in tempo reale. Posizionare la piastra creata come descritto al punto 7.6. nel sistema real-time PCR. Modificare le impostazioni; fornire un nome per l’esperimento, quindi selezionare 96 pozzetti (0,2 ml ) come tipo di esperimento del sistema, CT comparativa (ΔΔCT) come metodo di quantificazione, standard come modalità di esecuzione del sistema e reagenti verdi SYBR come reagenti per rilevare la sequenza target. Fornire i nomi per il campione e i miRNA bersaglio e nominare il campione e il miRNA bersaglio in ciascun pozzetto. Assegnare campioni duplicati per ottenere dati adatti a confermare i risultati e scegliere un campione di riferimento e il controllo endogeno. Per utilizzare il colorante come riferimento passivo, selezionate nessuno. Per eliminare la contaminazione incrociata del reagente, impostare la trascrittasi inversa negativa e un controllo non-modello per l’espressione dei miRNA. Successivamente, assicurarsi che il volume di reazione sia impostato su 20 μL e che le condizioni del ciclo PCR siano impostate come segue: 95 °C per 15 minuti, quindi 40 cicli di denaturazione a 94 °C per 15 s, ricottura a 55 °C per 30 s e infine estensione a 70 °C per 30 s. Fare clic su analizza nel programma software del sistema per analizzare i dati qRT-PCR al termine del processo. Verificare che la linea di soglia selezionata automaticamente dal programma sia appropriata per ciascun pozzetto. Controllare il valore del ciclo di soglia (CT) del controllo endogeno e dei miRNA bersaglio analizzati in ciascun campione. Determinare i valori CT mediante l’intersezione della curva di amplificazione e della linea di soglia.NOTA: Nel presente studio, RNU6-2 e miRNA-423-5p sono stati utilizzati come controlli endogeni per i livelli di espressione dei miRNA bersaglio e il metodo ΔΔCT è stato utilizzato per determinare i livelli di espressione relativi di ciascun miRNA bersaglio18.