Стереотаксическая вирусная инъекция и имплантация линз с градиентным индексом для глубокой визуализации кальция in vivo

Экспериментальный протокол следует рекомендациям по уходу за животными Университета Вайоминга. Мышь, используемая в этом исследовании, является 6-месячным самцом C57BL/6J. Процедура может быть использована для нацеливания на любые глубокие области мозга для визуализации кальция in vivo . Здесь, для демонстрации, целевой областью мозга является мышь mPFC (передняя и задняя (A / P): 1,94 мм, медиальная и латеральная (M / L): 0,5 мм, дорсальная и вентральная (D / V): 1,8 мм). Этот протокол модифицирован на основе ранее опубликованного протокола21. 1. Стереотаксическая инъекция вируса в mPFC (рисунок 1) Подготовка к операции Стерилизуйте все хирургические инструменты с помощью автоклава и поместите их на стерильную поверхность. Подготовьте шприц объемом 10 мкл, заправив его физиологическим раствором и предварительно засыпав 5 мкл физиологического раствора. Прикрепите шприц к микронасосу (см. Таблицу материалов). Включите грелку и поддерживайте температуру на уровне 35 °C. Поместите мышь в индукционную камеру (5″ x 10″ x 4″, длина x ширина x высота) с 5% изофлурана и скоростью потока кислорода 1 л/мин. Внимательно следите и подсчитывайте частоту дыхания мыши. Выньте мышь, как только ее частота дыхания уменьшится до 1 вдоха / с.ПРИМЕЧАНИЕ: Частоту дыхания мыши можно легко контролировать, наблюдая за движением мышц спины вниз и вверх во время каждого вдоха. Позвольте мыши расположиться на настольной области, отделенной от хирургической области. С помощью машинки для стрижки для бритья сбрите волосы от головы мыши до первых шейных позвонков. Поместите мышь на стереотаксическую сцену (см. Таблицу материалов) и закрепите ее положение с помощью ушных вкладышей и носового зажима. Поддерживать поступление изофлурана в стереотаксическую стадию при 1,5% изофлурана и 0,5 л/мин скорости потока кислорода. Нанесите смазывающую офтальмологическую глазную мазь на оба глаза чистым ватным тампоном, чтобы предотвратить сухость глаз во время операции. Оцените педальные рефлексы на мыши, чтобы подтвердить, что мышь полностью обезболена перед началом операции. Дезинфицируйте безволосую область 7,5% раствором повидона-йода (см. Таблицу материалов) и 70% этанолом три раза каждый с помощью стерильных ватных тампонов. Вводят небольшой объем (50 мкл) 2% лидокаина под кожу безволосой области. Сделайте разрез 2 см через кожу вдоль средней линии с помощью скальпеля, чтобы обнажить лямбду и брегму черепа. Удалите фасцию с черепа с помощью сухих ватных тампонов и заостренных щипцов. После того, как брегма и лямбда видны, используйте кончик зубного бормашины (диаметром 0,5 мм) для измерения Z-координат брегмы и лямбды (см. Таблицу материалов). Отрегулируйте высоту держателя носа до тех пор, пока брегма и лямбда не окажутся в одном положении Z. Расположите зубной бурильщик диаметром 0,5 мм в положении A/P: 1,94 мм, M/L: 0,5 мм от брегмы. Просверлите череп.ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, для демонстрации, целевой областью мозга является mPFC мыши. Этот протокол может быть использован для нацеливания на любую другую глубокую область мозга. Например, если целевой областью мозга является Прилежащее ядро (NAc), соответствующая позиция должна быть A/P: 0,9 мм, M/L: 1,2 мм. Удалите твердое тело с помощью наконечника иглы весом 30 г и очистите все куски костного мусора с помощью острых щипцов под углом 45°.ПРИМЕЧАНИЕ: Кровотечение распространено, так как мелкие кровеносные сосуды могут быть разорваны во время этапа очистки. Используйте стерильные ватные тампоны, чтобы остановить кровотечение, и нанесите физиологический раствор для мытья области. Нанесите физиологический раствор на открытую область черепа, чтобы сохранить его влажным. Загрузите вирус в шприц микролитра с помощью панели управления микронасосом. Вывести 500 нл воздушного пузыря, а затем 800 нл вируса со скоростью потока 50 нл/с.ПРИМЕЧАНИЕ: Для демонстрационных целей здесь в mPFC вводится аденоассоциированный вирус серотипа 1 (AAV1), экспрессирующий GCaMP6f (GECI), AAV1-CamKII-GCamp6f (см. Таблицу материалов). Титр вируса составляет 2,8 х 1013 ГК/мл. Его 1:2 разводят в физиологическом растворе перед инъекцией. Поместите кончик иглы на верхнюю часть брегмы, чтобы просто коснуться брегмы, и запишите Z-координату брегмы. Переместите иглу над просверленным отверстием и введите 100 нл вируса, чтобы убедиться, что игла не засорена. Медленно переместите иглу в мозговую ткань к целевой Z-координате D/V: 1,75 мм, а затем слегка переместите ее вверх до Z-координаты D/V: 1,65 мм.ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается для создания небольшого кармана для введения вирусного раствора. Если целевой областью мозга является NAc, то соответствующая целевая Z-координата D/V должна составлять 4,2 мм, а затем слегка переместиться до 4,1 мм. Используйте панель управления, чтобы настроить микронасос на впрыскивание 500 нЛ вируса со скоростью потока 50 нЛ/мин. Нажмите кнопку RUN на панели управления, чтобы внедрить вирус.ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция займет около 10 минут. После того, как инъекция закончится, подождите еще 5-10 минут, прежде чем вынимать иглу из мозга. Часто применяйте физиологический раствор, чтобы держать открытую область черепа влажной в период инъекции. Переместите иглу вверх и из мозга. Впрыскивание 500 нЛ объем дважды при скорости потока 50 нЛ/с.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг подтверждает, что надлежащий объем вируса был введен в мозг. Во время первых инъекций 500 нЛ вирус высвобождается, за которым следуют пузырьки воздуха. Во время второй инъекции 500 нЛ сначала появляются пузырьки воздуха, а затем физиологический раствор. Теперь шприц готов загрузить вирус для следующей мыши. После операции шприц и игла микролитра тщательно очищаются ацетоном, а затем физиологическим раствором. Выровняйте края кожи и аккуратно закройте разрез швом (размер 4,0). Нанесите антибиотическую мазь на область шва, чтобы предотвратить инфекцию. Выньте мышь из стереотаксической стадии и верните ее в домашнюю клетку. Поместите домашнюю клетку в инкубатор при температуре 33 °C до тех пор, пока мышь не станет амбулаторной.ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мыши требуется 10-15 минут, чтобы проснуться от изофлурановой анестезии, прежде чем она начнет двигаться. После того, как мышь начнет двигаться, вводят нестероидные противовоспалительные препараты в течение 3 послеоперационных дней (см. Таблицу материалов). Дайте мыши восстановиться после операции в течение 14 дней, прежде чем проводить имплантацию хрусталика GRIN. 2. Имплантация хрусталика GRIN в mPFC (рисунок 1) Подготовка к операции Готовят искусственную спинномозговую жидкость (ACSF), содержащую 124 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ NaH2PO4, 1,2 мМ MgCl2, 25 мМ глюкозы, 26 мМ NaHCO3 и 2,4 мМ CaCl2. Стерилизуйте все хирургические инструменты с помощью автоклава и поместите их на стерильную поверхность. Включите грелку и поддерживайте температуру на уровне 35 °C. Растопить 1% агарозы и держать на водяной бане при 42 °C до использования.ПРИМЕЧАНИЕ: Расплавленную агарозу можно держать на водяной бане в течение нескольких часов. Продезинфицируйте линзу GRIN (диаметром 1 мм, длиной 4,38 мм, рисунок 2A) в 70% этаноле в течение 15 минут, переложите ее в трубку, заполненную физиологическим раствором, чтобы правильно промыть ее перед имплантацией.ПРИМЕЧАНИЕ: Линзы GRIN (см. Таблицу материалов) производятся путем серебряного и литий-ионного обмена в специальных стеклах, что делает их нетоксичными и дружественными к нейронам 6,7. Тем не менее, многие коммерчески доступные линзы GRIN могут выщелачивать токсичные остатки, вызывая нейродегенерацию, что делает их непригодными для имплантации в живой мозг для долгосрочных исследований визуализации in vivo. Эти линзы GRIN могут потребовать покрытия биосовместимыми агентами, такими как парилен-С, для предотвращения токсических побочных эффектов на соседние нейроны22. Взвешивают мышь и обезболивают ее внутрибрюшинной инъекцией смеси кетамина/ксилазина (см. Таблицу материалов) (кетамин: 100 мг/кг; Ксилазин: 15 мг/кг).ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши весом 30 г требуется 300 мкл смеси кетамина/ксилазина (кетамин 100 мг/мл и ксилазин 1,5 мг/мл) для начальной дозы и 150 мкл кетамина (10 мг/мл) для дополнительных доз во время операции. Чтобы мышь оставалась обезболенной в течение всего хирургического процесса, необходимо вводить дополнительные дозы кетамина (50 мг/кг) не реже одного раза в час. Стадия анестезии мыши должна часто контролироваться путем оценки педальных рефлексов. Сбрите волосы с хирургической области бритвой и очистите волосы с помощью влажного бумажного полотенца. Поместите мышь в стереотаксическую стадию и закрепите ее положение, затянув зажим для носа и ушные вкладыши. Нанесите смазывающую офтальмологическую глазную мазь на оба глаза стерильным ватным тампоном. Убедитесь, что мышь полностью обезболена, оценив педальные рефлексы. Продезинфицируйте безволосую область 7,5% раствором повидона-йода и 70% этанолом три раза каждый, используя стерильные ватные тампоны. Вводите 2 мг / кг дексаметазона внутримышечно в бедро, чтобы снизить риск отека и воспаления, связанных с хирургическим вмешательством. Вводят 50 мкл 2% Лидокаина под кожу области операции. Используйте тонкие ножницы, чтобы иссечь треугольную область кожи размером 1,5 см (высота) x 1,0 см (основание), от передней стороны между глазами до задней стороны позади лямбды. Удалите ткань надкостницы из черепа с помощью тонких щипцов, микролопастей и ватных тампонов.ПРИМЕЧАНИЕ: Череп должен быть тщательно очищен и высушен, прежде чем приступать к следующему шагу. Нанесите цианоакрилат (см. Таблицу материалов) на края кожи и прикрепите кожу к черепу. Подождите 5 мин, пока цианоакрилат не высохнет. С помощью наконечника бурового заусенца диаметром 0,5 мм выровняйте брегму и лямбду в одной горизонтальной плоскости, отрегулировав высоту носового зажима. Расположите бормашину (диаметром 1,2 мм) в положение A/P: 1,94 мм, M/L: 0,8 мм от брегмы. Просверлите череп. Удалите твердое тело с помощью наконечника иглы весом 30 г и очистите все куски костного мусора с помощью острых щипцов под углом 45°.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот костный мусор может блокировать последующую стадию аспирации, если не удалить полностью. Прикрепите вручную отполированную тупостороннюю иглу 27 G (рисунок 2B) к держателю иглы, соединенному с роботизированной рукояткой, наклоненной под углом 10° (рисунок 2C). Подключите другой конец игольчатого держателя к домашней вакуумной системе.ПРИМЕЧАНИЕ: Роботизированная рука (см. Таблицу материалов) разработана группой доктора Лина в NIDA/IRP и управляется специально разработанным программным обеспечением открытого доступа AutoStereota (https://github.com/liang-bo/AutoStereota)23 Найдите кончик иглы, чтобы просто коснуться брегмы. Установите Z-координату брегмы в 0, нажав на кнопку Bregma на AutoStereota. Установите входное значение X равным 0,8, входное значение Y 1,94, входное значение Z равным 1,0, затем нажмите кнопку «Найти», чтобы переместить иглу на верхнюю часть просверленного отверстия на черепе. Отрегулируйте положение иглы к центру открытой области мозговой ткани с помощью AutoStereota.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы переместить иглу в боковом или медиальном направлении, введите значение Шага и нажмите боковые или медиальные кнопки на AutoStereota. Аналогично, чтобы переместить иглу в переднем или заднем и дорсальном или вентральном направлениях, нажмите на ростральные или каудальные и дорсальные или вентральные кнопки соответственно. Включите вакуум и начните промывать открытую область мозга с помощью ACSF через систему трубок с гравитационной системой (см. Таблицу материалов), подключенную к игле 30 G с изогнутым наконечником. ACSF непрерывно пузырится с газовой смесью 95% O2 и 5% CO2 и фильтруется через фильтр 0,2 мкм.ПРИМЕЧАНИЕ: Расход ACSF составляет ~ 1,5 мл/мин. Выходное давление газовой смеси поддерживается на уровне ~3 psi. Аспирация мозговой ткани слой за слоем с помощью программного обеспечения AutoStereota (Рисунок 3).ПРИМЕЧАНИЕ: Аспирация мозговой ткани завершается в 4 раунда таким образом, чтобы образовался карман колонны (1,8 мм в глубину и 1 мм в диаметре).В сеансе “zStep” щелкните и проверьте первую и вторую строки. Задайте значения для первой строки равными 0,2 и 1. Установите значения для второй строки в 0,15 и 4 (рисунок 3A). В сеансе “Режим” установите Размер иглы 27 Калибр и 1.2, установите Dims 0.9. Все остальные значения используют значения по умолчанию (рисунок 3A). Последовательно нажмите кнопки Set, Keep Zero и Start , чтобы начать стремление.ПРИМЕЧАНИЕ: Это1-й раунд стремления. Входные значения указывают на то, что глубина аспирации составляет 0,2 мм (от Z-координаты 0) во время первой ступени с 1 слоем; на втором этапе глубина аспирации составляет 0,15 мм, непрерывно повторяется на протяжении 4 слоев. Разрешение аспирации составляет 1,2, а диаметр 0,9 мм. Во время аспирации мгновенное расположение кончика иглы можно контролировать через панель графика трека. После завершения этого аспирационного раунда создается карман колонны глубиной 0,8 мм и диаметром 1 мм. Кончик иглы вернется к центру с Z-координатой 0. В сеансе “zStep” щелкните и проверьте первую и вторую строки. Задайте значения для первой строки равными 1 и 1. Установите значения для второй строки в 0,15 и 4 (рисунок 3B). В сеансе “Mode” сохраните все значения такими же, как и в предыдущем раунде (рисунок 3B). Последовательно нажмите кнопки Set, Keep Zero и Start , чтобы начать стремление.ПРИМЕЧАНИЕ: Это2-й раунд стремления. Входные значения указывают на то, что глубина аспирации составляет 1 мм (от Z-координаты 0) во время первой ступени с 1 слоем; на втором этапе глубина аспирации составляет 0,15 мм, непрерывно повторяется на протяжении 4 слоев. После завершения этого аспирационного раунда создается карман колонны глубиной 1,6 мм и диаметром 1 мм. В сеансе “zStep” щелкните и проверьте только первую строку. Установите значения для первой строки в 1.8 и 1 (рисунок 3C). В сеансе “Режим” установите размер иглы 27 Калибр и 2.2. Все остальные значения остаются такими же, как и в предыдущем раунде (рисунок 3C). Последовательно нажмите кнопки Set, Keep Zero и Start , чтобы начать стремление.ПРИМЕЧАНИЕ: Это3-й раунд аспирации. Входные значения указывают на глубину аспирации 1,8 мм (от Z-координаты 0) с 1 слоем. Резолюция о стремлении — 2.2. После завершения этого аспирационного раунда создается карман колонны глубиной 1,8 мм и диаметром 1 мм. В сеансе “zStep” щелкните и проверьте только первую строку. Установите значения для первой строки в 1.6 и 1 (рисунок 3D). В сеансе “Режим” установите Размер иглы 27 Калибр и 2.2, установите Dims 0.6 (Рисунок 3D). Последовательно нажмите кнопки Set, Keep Zero и Start , чтобы начать аспирацию.ПРИМЕЧАНИЕ: Это4-й раунд аспирации. Целью этого шага является очистка крови, скопившейся в кармане. Кровотечение распространено, так как мелкие кровеносные сосуды разрываются во время процесса аспирации. Чтобы тщательно очистить кровь, прекратите орошение ACSF на 5 минут, а затем снова включите орошение. Повторите4-й раунд аспирации несколько раз, пока карман не освободится от крови. Этот протокол может быть использован для нацеливания на любые другие глубокие области мозга. Например, если целевой областью мозга является NAc, конечная соответствующая Z-координата D/V должна составлять 4,4 мм. Остановите вакуум и орошение ACSF. Доведите иглу до +2 мм Z-координаты и 0,5 мм спереди к центру. Поместите стерильную линзу GRIN 1 мм в карман. Держите кончик иглы в контакте с открытой линзой GRIN, чтобы обеспечить оседание линзы GRIN под углом 10°. Осторожно прижмите верхнюю поверхность линзы GRIN стерильной бумагой для мягких папирос, чтобы нижняя поверхность линзы GRIN контактировала с мозговой тканью. Нанесите расплавленную агарозу в щель между хрусталиком GRIN и мозговой тканью с помощью шпателя. После того, как Агароза образует гель, удалите избыток Агарозы с помощью микролопасти. Тщательно очистите череп солевыми и ватными тампонами. Дайте черепу высохнуть перед последующим нанесением зубного цемента (см. Таблицу материалов). Выньте хорошо перемешиваемую скважину из морозильной камеры при температуре -20 °C. Смешайте порошок зубного цемента и каталитическую жидкость и нанесите слой самоотверждающегося клейкого смоляного цемента на череп; сначала окружите линзу GRIN, а затем охватите весь открытый череп. Подождите 5 минут и дайте ему полностью затвердеть. Аккуратно извлеките аспирационную иглу. В чистом пластиковом колодце смешайте зубной цементный порошок, черный уголь с жидкостью, а сверху на 1-й слой зубного цемента нанесите тонкий слой смеси. Подождите 5 минут, чтобы дать ему затвердеть. Защитите экспонированную линзу GRIN, покрыв ее специальным колпачком, изготовленным из трубки ПЦР (рисунок 2D). Нанесите цианоакрилат, чтобы прикрепить колпачок к зубному цементу. Вводят 1 мл предварительного физиологического раствора подкожно мыши, а затем 0,1 мг/кг бупренорфина. Поместите мышь обратно в ее домашнюю клетку. Поместите домашнюю клетку в инкубатор с температурой 33 °C и следите за мышью, пока она не станет амбулаторной. Обычно мыши требуется 20-40 минут, чтобы проснуться от анестезии, прежде чем она начнет двигаться. Вводите нестероидные противовоспалительные препараты и контролируйте мышь в течение не менее 3 послеоперационных дней. Дайте мыши восстановиться после операции в течение 30 дней. 3. Прикрепление держателя минископа (основания) к черепу мыши (рисунок 1) Обезболивают мышь в индукционной камере 5% изофлураном и скоростью потока кислорода 1 л/мин до тех пор, пока скорость дыхания не снизится до 1 вдоха/с. Поместите мышь в стереотаксическую сцену и закрепите ее положение с помощью ушных вкладышей и зажимов для носа. Поддерживать непрерывный поток изофлурана (1,5%) и кислорода (0,5 л/мин). Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы сохранить их влажными. Включите грелку и поддерживайте температуру на уровне 35 °C. Убедитесь, что мышь полностью обезболена, оценив педальные рефлексы. Аккуратно снимите колпачок, закрывающий линзу GRIN, с помощью заостренных щипцов. Сверлите высушенные остатки цианоакрилата из зубного цемента полностью с помощью микродрилла (см. Таблицу материалов). Обрежьте волосы вокруг области зубного цемента небольшими ножницами. Очистите мусор с помощью пылесоса со сжатым воздухом. Используйте ацетоновый ватный тампон для очистки верхней поверхности линзы GRIN. Подготовьте минископ с его держателем (основанием). Поместите шестигранную гайку #00-90 (см. Таблицу материалов) в прорезь, присутствующую в основании, и нанесите цианоакрилат, чтобы закрепить его там (рисунок 2E). Плотно нанесите полиэтиленовую ленту (PTFE) вокруг резьбы минископа и обрежьте дополнительную ленту (рисунок 2F). Прикрепите минископ к основанию и используйте стопорный винт для крепления минископа к основанию (рисунок 2G). Подключите минископ к кабелю и включите специально разработанное программное обеспечение с открытым доступом NeuView (см. Таблицу материалов).ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение NeuView специально разработано для визуализации кальция в минископе in vivo из группы доктора Лина в NIDA/IRP 7,12. Это открытый доступ (https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0). В NeuView щелкните Hardware, проверьте LED1 и нажмите кнопку Stream , чтобы просмотреть живые изображения (рисунок 4A). Чтобы остановить прямую трансляцию, нажмите кнопку Стоп . Поместите минископ в специально изготовленный кронштейн минископа (рисунок 2H), положением XYZ которого можно манипулировать с помощью моторизованных контроллеров (рисунок 2I). Расположите минископ чуть выше экспонированного объектива GRIN и сделайте его параллельным поверхности объектива. Медленно опустите минископ к объективу GRIN и отрегулируйте его положение Z, пока не будет найдена лучшая плоскость фокусировки.ПРИМЕЧАНИЕ: Наилучшая фокальная плоскость определяется путем сравнения нескольких возможных положений Z и выбора фокальной плоскости с четкой визуализацией большинства тел клеток. Аккуратно нанесите первый слой зубного цемента вокруг основания минископа, не изменяя положения минископа. После того, как цемент затвердеет, аккуратно снимите удерживающую руку так, чтобы минископ мог самостоятельно стоять на головке мыши.ПРИМЕЧАНИЕ: Зубной цемент имеет тенденцию сжиматься после затвердевания, и он будет тянуть вниз минископ от исходной плоскости фокусировки. Как правило, положение минископа Z слегка приподнимается над исходной фокальной плоскостью перед нанесением зубного цемента для компенсации потенциального изменения. Нанесите второй слой зубного цемента вокруг основания, чтобы заполнить все зазоры и убедиться, что из зазоров нет утечки светодиодного света. Дайте зубному цементу затвердеть. Извлеките мышь из стереотаксической стадии. Ослабьте стопорный винт и отсоедините минископ от основания. Поместите защитный колпачок с 3D-печатью в основание, чтобы защитить открытую линзу GRIN, и затяните стопорный винт в основании (рисунок 2J). Поместите мышь обратно в ее домашнюю клетку.ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мыши требуется 10-15 минут, чтобы проснуться от изофлурановой анестезии, прежде чем она начнет двигаться. 4. Монтаж минископа и визуализация in vivo Ca2+ (рисунок 1) Крепление минископа к его основанию Ненадолго обезболивают мышь в индукционной камере (5% изофлурана и скорость потока кислорода 1 л/мин). Поместите мышь на чистую поверхность скамейки. Ослабьте стопорный винт небольшой отверткой, снимите защитный колпачок и очистите поверхность линзы GRIN пропитанным ацетоном ватным тампоном. Плотно оберните ленту из PTFE вокруг резьбы минископа и прикрепите минископ к его основанию на головке мыши. Подключите минископ к кабелю (рисунок 2K), включите программное обеспечение NeuView. В NeuView щелкните Hardware, проверьте LED1 и нажмите кнопку Stream , чтобы просмотреть живые изображения (рисунок 4A). Определите наилучшую фокальную плоскость, отрегулировав положение минископа относительно основания, либо слегка затягивая, либо ослабляя с помощью тупых щипцов.ПРИМЕЧАНИЕ: Наилучшая фокальная плоскость определяется путем сравнения нескольких возможных мест и выбора одного с четкой визуализацией большинства клеточных тел. Затяните стопорный винт и поместите мышь обратно в домашнюю клетку. В NeuView отрегулируйте мощность светодиодного индикатора до оптимального уровня. Нажмите «Захват», а затем «Триггер», чтобы начать запись, и нажмите «Стоп» через 150 кадров.ПРИМЕЧАНИЕ: Минимально возможная мощность определяет оптимальный уровень мощности светодиода для достижения достаточно яркого изображения. Целью записи короткого видео является облегчение идентификации одной и той же фокальной плоскости в будущем для повторяющейся визуализации. Отсоедините кабель от минископа. Дайте мыши восстановиться не менее чем за 30 минут до начала эксперимента.ПРИМЕЧАНИЕ: Для защиты минископа, как правило, бутылка с водой и проволочное устройство подачи пищевых продуктов удаляются в течение этого короткого периода времени. Если мыши необходимо дольше оставаться в своей домашней клетке, рекомендуется поставлять коммерчески доступный диетический гель (см. Таблицу материалов) в домашнюю клетку. Сбор данных для визуализации кальция in vivoПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация кальция In vivo может проводиться одновременно с любыми поведенческими тестами, которые пожелает исследователь. Для демонстрационных целей приведенным здесь примером является визуализация in vivo Ca2+ во время испытания в открытом поле. Для достижения этой цели требуется два компьютера. Один компьютер оснащен коммерческим программным обеспечением (см. Таблицу материалов) для управления камерой для автоматической записи поведения мыши. Другой компьютер оснащен NeuView для управления минископом и записи изображений Ca2+ . Включите программное обеспечение поведенческой камеры (см. раздел Таблица материалов), чтобы просмотреть арену поведения мыши с помощью функции Livestream. Вручную отрегулируйте фокус верхней камеры (рисунок 2L). Выберите Триггер/Строб и установите флажок “Включить/выключить триггер” (рисунок 4B). Нажмите кнопку Запись , используйте Обзор , чтобы выбрать место, где будут сохранены записи поведения, выберите нужный формат изображения.ПРИМЕЧАНИЕ: Функция “Trigger Control” включена, чтобы позволить программному обеспечению NeuView инициировать запись поведения, так что кадры поведения и соответствующие кадры визуализации кальция временно связаны друг с другом. Запись поведения может быть сохранена в любом желаемом формате. Запись поведения обычно сохраняется в формате JPEG в указанной папке. Поднесите мышь близко к арене и подключите минископ к кабелю, подключенному к системе сбора данных (рисунок 2L) (см. Таблицу материалов). Затем мышь помещается в центр арены. С помощью функции Livestream программного обеспечения NeuView отрегулируйте мощность светодиодов для оптимизации яркости изображения кальцием.ПРИМЕЧАНИЕ: Для кальциевой визуализации частота кадров записи по умолчанию составляет 10 кадров/с. В NeuView снимите флажок LED1, нажмите кнопки Capture , а затем Triggers , чтобы начать запись, и нажмите Stop через 100 кадров.ПРИМЕЧАНИЕ: Это для записи фоновых изображений в течение примерно 100 кадров с выключенным светодиодным светом. В программном обеспечении поведенческой камеры щелкните Начать запись (рисунок 4C). В NeuView проверьте LED1, нажмите «Захват», а затем «Триггерные кнопки», чтобы начать запись. Нажмите Стоп после 3000 кадров.ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается для одновременной записи изображений и поведения кальция. Испытание в открытом поле длится 15 минут, обычно разбивается на три сеанса записи по 5 минут каждый. Это делается для предотвращения перегрева минископа из-за постоянного использования. Сохраняйте изображения кальция и записи поведения в указанных папках. Повторяйте запись еще в течение двух сеансов, записывая фон перед каждым сеансом, и сохраняйте все записи в указанной папке. Отсоедините минископ от его основания. После завершения записи отсоедините кабель от минископа. Ненадолго обезболивают мышь в индукционной камере (5% изофлурана и 1 л/мин скорости потока кислорода). Поместите мышь на чистую, теплую поверхность. Открутите стопорный винт в основании и отсоедините минископ от основания. Наденьте защитный колпачок на основание и затяните стопорный винт. Поместите мышь обратно в ее домашнюю клетку.