Miniscope في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي هو تقنية قوية لدراسة ديناميكيات الخلايا العصبية والدوائر الدقيقة في الفئران التي تتصرف بحرية. يصف هذا البروتوكول إجراء جراحات الدماغ لتحقيق تصوير الكالسيوم الجيد في الجسم الحي باستخدام منظار مصغر.
المجهر الفلوري المصغر (miniscope) هو أداة قوية لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي من الحيوانات التي تتصرف بحرية. يوفر العديد من المزايا على أنظمة تصوير الكالسيوم التقليدية متعددة الفوتونات: (1) مدمجة. (2) خفيفة الوزن؛ (3) بأسعار معقولة؛ و (4) يسمح بالتسجيل من الحيوانات التي تتصرف بحرية. يصف هذا البروتوكول جراحات الدماغ لتصوير الكالسيوم العميق في الدماغ في الجسم الحي باستخدام نظام تسجيل مصغر تم تطويره خصيصا. يتكون إجراء التحضير من ثلاث خطوات ، بما في ذلك (1) حقن الفيروس بشكل نمطي في منطقة الدماغ المطلوبة من دماغ الفأر لتسمية مجموعة فرعية محددة من الخلايا العصبية باستخدام مستشعر الكالسيوم المشفر وراثيا. (2) زرع عدسة مؤشر التدرج (GRIN) التي يمكنها نقل صورة الكالسيوم من منطقة الدماغ العميقة إلى نظام المنظار المصغر ؛ و (3) تثبيت حامل المنظار المصغر على جمجمة الماوس حيث يمكن إرفاق المنظار المصغر لاحقا. لإجراء تصوير الكالسيوم في الجسم الحي ، يتم تثبيت المنظار المصغر على الحامل ، ويتم جمع صور الكالسيوم العصبية جنبا إلى جنب مع تسجيلات السلوك المتزامنة. بروتوكول الجراحة الحالي متوافق مع أي أنظمة تصوير تجارية أو مصممة خصيصا أحادية الفوتون وثنائية الفوتون لتصوير الكالسيوم العميق في الدماغ في الجسم الحي .
تعد إشارات Ca2+ داخل الخلايا منظما أساسيا لنمو الخلايا وانتشارها وتمايزها والهجرة ونسخ الجينات وإفرازها وموت الخلايا المبرمج1. في الخلايا العصبية ، يتم التحكم بدقة في إشارات Ca2+ لأن نمطها المكاني الزماني يرتبط بوظائف حاسمة مثل استثارة الغشاء ، وإطلاق الناقل العصبي ، واللدونة المشبكية2.
يعد تصوير الكالسيوم في الجسم الحي تقنية قوية يمكن استخدامها لفك تشفير تمثيل الدائرة العصبية كعنصر أساسي في السلوكيات الحيوانية الطبيعية ، وتحديد الأنشطة العصبية الشاذة في النماذج الحيوانية لاضطرابات الدماغ ، وكشف الأهداف العلاجية المحتملة التي قد تطبيع هذه الدوائر المتغيرة. الاثنان الشائعان في أنظمة تصوير الكالسيوم في الجسم الحي هما المجهر الفلوري للمسح بالليزر ثنائي الفوتون3،4،5،6 والتنظير المجهري المصغر المثبت على الرأس (miniscope) 7،8،9،10،11،12،13 . يوفر المجهر التقليدي ثنائي الفوتون مزايا قيادية مثل دقة أفضل وضوضاء أقل وتبييض ضوئي أقل. ومع ذلك ، يطلب من التجارب أن تكون ثابتة الرأس ، مما يحد من دراسات السلوك التي يمكن إجراؤها3،4،5،6. على النقيض من ذلك ، فإن نظام المنظار المصغر المثبت على الرأس صغير ومحمول ، مما يجعل من الممكن دراسة مجموعة واسعة من اختبارات السلوك باستخدام تتصرف بحرية7،8،9،10،11،12،13.
هناك مؤشران رائدان ل Ca2+ ، وهما المؤشرات الكيميائية5,14 ومؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) 15,16. تم تسهيل تصوير Ca2+ باستخدام GECIs عالية الحساسية التي يتم تسليمها مع ناقلات فيروسية تسمح بوضع علامات محددة على الخلايا العصبية في الدائرة المستهدفة. إن الجهد المستمر لتعزيز الحساسية وطول العمر والقدرة على تسمية حتى المقصورات تحت الخلوية ، يجعل GECIs مثالية لمختلف دراسات تصوير الكالسيوم في الجسم الحي 17،18،19.
إن تشتت الضوء في أنسجة المخ أثناء التصوير يحد من الاختراق البصري في العمق ، حتى مع المجهر ثنائي الفوتون. ومع ذلك ، فإن عدسة مؤشر التدرج (GRIN) تتغلب على هذه المشكلة حيث يمكن تضمين عدسة GRIN مباشرة في الأنسجة البيولوجية ونقل الصور من منطقة الدماغ العميقة إلى هدف المجهر. على عكس العدسة التقليدية المصنوعة من مواد متجانسة بصريا وتتطلب سطحا معقدا الشكل للتركيز وإنشاء الصور ، يعتمد أداء عدسة GRIN على تغيير معامل الانكسار التدريجي داخل مادة العدسة التي تحقق التركيز البؤري مع سطح المستوى20. يمكن تصنيع عدسة GRIN حتى قطر 0.2 مم. لذلك ، يمكن زرع عدسة GRIN مصغرة في الدماغ العميق دون التسبب في الكثير من الضرر.
في هذه المقالة ، يتم تقديم بروتوكول جراحة كامل للدماغ العميق في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي. لغرض العرض التوضيحي ، نصف جراحات الدماغ التي تستهدف على وجه التحديد قشرة الفص الجبهي الإنسي (mPFC) لدماغ الفأر وتسجيل تصوير الكالسيوم في الجسم الحي عبر نظام منظار مصغر مصمم خصيصا طورته مجموعة الدكتور لين في المعهد الوطني لتعاطي المخدرات (NIDA / IRP) 7,12. يتضمن الإجراء التجريبي عمليتين جراحيتين رئيسيتين في الدماغ. الجراحة الأولى هي حقن ناقل فيروسي بشكل نمطي يعبر عن GCaMP6f (GECI) في mPFC. الجراحة الثانية هي زرع عدسة GRIN في نفس منطقة الدماغ. بعد التعافي من جراحات الدماغ هذه ، فإن الإجراء اللاحق هو تثبيت حامل المنظار المصغر (القاعدة) على جمجمة الفأر باستخدام أسمنت الأسنان. في الجسم الحي يمكن إجراء تصوير Ca2+ في أي وقت بعد تركيب المنظار المصغر على قاعدته. بروتوكول الجراحة للحقن الفيروسي وزرع عدسة GRIN متوافق مع أي أنظمة تصوير تجارية أو مصممة خصيصا أحادية الفوتون وثنائية الفوتون للدماغ العميق في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي.
السؤال المركزي في علم الأعصاب هو فهم كيفية تشفير الديناميكيات والدوائر العصبية للمعلومات وتخزينها ، وكيف يتم تغييرها في أمراض الدماغ. باستخدام منظار مصغر في الجسم الحي Ca2+ نظام التصوير ، يمكن مراقبة النشاط العصبي الفردي من عدة مئات من الخلايا العصبية داخل الدائرة الدقيقة المحلية في وقت واحد من يتصرف بحرية. هنا ، يتم وصف بروتوكول جراحي مفصل للحقن الفيروسي وزرع عدسة GRIN لإعداد القوارض لتصوير دماغ عميق في الجسم الحي Ca2+ عبر نظام تسجيل مصغر تم تطويره خصيصا. يوضح الجدول 1 مقارنات نظام miniscope الخاص بنا مع أنظمة miniscope الأخرى المتاحة تجاريا والمصممة خصيصا 7,8,9,10,11,13,25,26. تجدر الإشارة إلى أن زرع عدسة GRIN باستخدام البروتوكول الجراحي الحالي متوافق مع أي أنظمة تصوير تجارية أو مصممة خصيصا بفوتون واحد وفوتون اثنين لدماغ عميق في الجسم الحي تصوير الكالسيوم.
من الحقن الفيروسي إلى الحصول على البيانات من miniscope في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي ، يستغرق الإجراء التجريبي بأكمله ما لا يقل عن 2 أشهر لإكماله. إنها عملية معقدة وكثيفة العمالة. يعتمد النجاح النهائي للتجربة على عوامل متعددة ، بما في ذلك الاختيار السليم ل GECIs ، وحقن الفيروس بدقة في منطقة الدماغ المستهدفة ، والتعبير الفيروسي الكافي في السكان العصبيين المطلوبين ، وزرع عدسة GRIN بدقة في الموقع المطلوب ، والشفاء الكافي من العمليات الجراحية ، وكذلك ، ما إذا كان الالتهاب الحاد يحدث بعد الجراحة ، وما إذا كان سلوك الحيوان يتأثر بشدة بالعمليات الجراحية ، وهلم جرا.
وتشمل خطوتان حاسمتان الحقن المجسمة للفيروس وزرع عدسة GRIN. لغرض العرض التوضيحي ، تم إجراء الحقن المجهري المجسمة في الماوس mPFC ، مع تشفير الفيروس المرتبط بالغدي (AAV1) GCaMP6f تحت سيطرة مروج CaMKII الذي يقوم بتسمية الخلايا العصبية الهرمية بشكل انتقائي في mPFC. تم اختيار GCaMP6f لأنه واحد من أسرع مؤشرات الكالسيوم وأكثرها حساسية مع وقت نصف اضمحلال يبلغ 71 مللي ثانية15. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التعبير الفيروسي AAV ل GCaMP6f طويل الأمد (أي عدة أشهر) ، مما يجعله مثاليا لأداء التصوير المتكرر في الجسم الحي Ca2 + على مدى فترة طويلة للدراسات الطولية في نماذج الفئران للأمراض العصبية التنكسية27. يمكن تكييف بروتوكول الجراحة الحالي لاستهداف مجموعات الخلايا المختلفة في أي منطقة دماغية أخرى. تسمح العديد من الأدوات الفيروسية المتاحة بوضع علامات انتقائية على مجموعات عصبية محددة في منطقة الدماغ المطلوبة في العمر المطلوب. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للباحثين الاستفادة من نظام إعادة تركيب Cre-LoxP والعديد من نماذج الفئران المعدلة وراثيا المتاحة لإجراء تعديلات وراثية ودراسة نتائج الدوائر السلوكية والعصبية28,29.
إحدى السمات الفريدة للبروتوكول المقدم هي أن الشفط الآلي لأنسجة المخ طبقة تلو الأخرى تم إجراؤه قبل زرع عدسة GRIN (قطرها 1 مم). ويتحقق ذلك من خلال إبرة 27 G متصلة بنظام فراغ ، يتم التحكم فيها بواسطة ذراع روبوتية مصممة خصيصا وبرنامج23. استنادا إلى تجربتنا ، تولد هذه الطريقة سطحا موحدا لعدسة GRIN للاتصال بها وتسبب ضررا أقل للأنسجة المجاورة من شفط الأنسجة اليدوي23. لهذا السبب ، يجلب هذا الإجراء ميزة واضحة لعدسات GRIN ذات القطر الأوسع نسبيا (على سبيل المثال ، 1 مم). ومع ذلك، قد لا يكون شفط الأنسجة ضروريا لزرع عدسة GRIN بقطر أصغر (0.5 مم أو 0.25 مم). بدلا من ذلك ، يمكن زراعته مباشرة على طول المسار الرائد المصنوع بإبرة 30 G21.
إلى جانب الخطوتين الحاسمتين اللتين تمت مناقشتهما أعلاه ، يجب النظر بعناية في العديد من العوامل الأخرى من أجل نجاح العملية. (1) يجب تعقيم جميع الأدوات التي تتصل بالدماغ لمنع العدوى. (2) يجب إجراء جميع خطوات الجراحة لتقليل الضرر الذي يلحق بالدماغ لمنع المزيد من الالتهاب وتكوين الأنسجة الندبية المفرطة. (3) يجب النظر بعناية في جرعات التخدير التي تعطى في البداية ويتم الحفاظ عليها أثناء الجراحة ، وخاصة تلك التي تدار داخل الصفاق. يمكن تعديل جرعات التخدير وفقا لسلالات الفئران المختلفة ، حيث قد يكون بعضها أكثر عرضة للإصابة. (4) يجب مراقبة حالة الفأر باستمرار أثناء الجراحة. أخيرا ، (5) تحتاج الفئران إلى المراقبة بانتظام بعد الجراحة ، حيث قد تحدث العديد من المضاعفات بعد الجراحة.
على الرغم من إزالة جزء من أنسجة المخ من جانب واحد خلال خطوة زرع عدسة GRIN ، إلا أننا لم نلاحظ أي عجز سلوكي واضح 7,12. يبلغ وزن المنظار الصغير حوالي 2 جرام ، وقد تم تصميم الكابل خصيصا لجعله خفيفا ولضمان قدرة الماوس على حمله بسهولة. يتم توصيل المنظار الصغير والكابل فقط بالحيوان قبل التصوير في الجسم الحي وفصلهما بعد التصوير. عادة ما لا تستغرق عملية التصوير بأكملها أكثر من 30 دقيقة. لذلك ، لا تمنع هذه الأجهزة الماوس من التصرف بحرية. تحتاج خطوات التثبيت وإزالة المنظار المصغر إلى تخدير قصير (أقل من 2 دقيقة) مع الأيزوفلوران لغرض تقييد الحيوان. عادة ما نسمح للفأر بالتعافي من التعرض القصير للأيسوفلوران لمدة 30 دقيقة قبل إجراء التصوير في الجسم الحي. لقد أجرينا تصوير الكالسيوم المصغر في الجسم الحي مرة واحدة في الأسبوع لبضعة أسابيع دون ملاحظة أي تأثير على صحة الفئران والسلوك الاجتماعي للفأر12.
أحد القيود الرئيسية لنظام تسجيل المنظار المصغر الحالي هو الحاجة إلى توصيل المجهر بكبل للحصول على البيانات. يؤدي وجود الكابل في بعض الأحيان إلى تقييد أداء مهمة الماوس ويحد من تسجيل واحد في كل مرة. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير منظار لاسلكي مصغر25,26. سيؤدي ذلك إلى توسيع أداء المهمة والسماح بالتصوير المتزامن في الجسم الحي من متعددة في مجموعة. علاوة على ذلك ، فإن تطوير GECIs أكثر حساسية مع أطوال موجية قابلة للفصل الطيفي جنبا إلى جنب مع منظار مصغر مزدوج اللون سيوفر إمكانيات أكثر إثارة لأبحاث علم الأعصاب.
The authors have nothing to disclose.
يتم دعم هذا العمل من خلال منح من المعهد الوطني للصحة (NIH) 5P20GM121310 و R61NS115161 و UG3NS115608.
0.6mm and 1.2mm drill burrs | KF technology | 8000037800 | For craniotomy |
27-G and 30-G needle | BD PrecisionGlide Needle | REF 305109 and REF305106 | For both surgeries |
45 angled forceps | Fine Science tools | 11251-35 | For surgeries |
7.5% povidone-iodine solution (Betadine) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-151-17 | Surface disinfectant |
Acetone | Sigma-Aldrich | 179124-1L | GRIN lens cleaner |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539-25G | For GRIN lens implantation |
Antibiotic ointment | HeliDerm Technology | 81073087 | For virus injection |
Anti-inflamatory drug (Ibuprofen) | Johnson & Johnson Consumer Inc | 30043308 | Acts as pain killer after surgeries |
AutoStereota | NIDA/IRP | github.com/liang-bo/autostereota | For GRIN lens implantation |
Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2) | Point Grey | Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C | For recording behavior |
Brass hex nut | McMASTER-CARR | 92736A112 | For GRIN lens implantation |
Buprenorphine | Par Pharmaceuticals | NDC 4202317905 | For GRIN lens implantation |
Calcium chloride | Sigma | 10043-52-4 | For preparing aCSF |
Commutator | NIDA/IRP | Custom-designed | Component of image acquisition system |
Compressed Oxygen and Caxbondioxide tank | Rocky Mountain Air Solutions | BI-OX-CD5C-K | For GRIN lens implantation |
Compressed Oxygen tank | Rocky Mountain Air Solutions | OX-M-K | For virus injection |
Cordless Microdrill | KF technology | 8000037800 | For craniotomy |
Cyanoacrylate | Henkel Coorporation | # 1811182 | For GRIN lens implantation |
Data acquisition controller | NIDA/IRP | Custom-designed | Component of image acquisition system |
Data transmission cable | NIDA/IRP | Custom-designed | Component of image acquisition system |
Dental cement set | C&B Metabond and Catalyst | A00253revA306 and A00168revB306 | For GRIN lens implantation |
Dental cement set | Duralay | 2249D | For GRIN lens implantation |
Dexamethasone | VETone | NDC 1398503702 | For GRIN lens implantation |
Dextrose | Sigma | 50-99-7 | For preparing aCSF |
Diet gel | Clear H20 | 72-06-5022 | Diet Supplement for mouse |
GRIN lens | GRINTECH | NEM-100-25-10-860-S | For GRIN lens implantation |
Heating Pad | Physitemp Instruments LLC. | #10023 | To keep the mouse body warm during surgeries |
Isoflurane | VETone | V1 502017 | Anesthesia |
Ketamine | VETone | V1 501072 | For GRIN lens implantation |
Lidocaine | WEST-WARD | NDC 0143-9575-01 | Local anesthesia |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | 7791-18-6 | For preparing aCSF |
Microliter syringe (Hamilton) | Hamilton | 7653-01 | For virus injection |
MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instrument | #178647 | For virus injection |
Miniscope | NIDA/IRP | Custom-designed | For imaging |
Miniscope base | Protolabs | Custom-designed | For mounting the base |
Miniscope holding arm | NIDA/IRP | Custom-designed | For mounting the base |
Miniscope protection cap | Protolabs | Custom-designed | For protecting the miniscope |
Motorized controller | Thorlabs | KMTS50E | For mounting the base |
NeuView | NIDA/IRP | https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0 | For in vivo imaging |
Ophthalmic ointment | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | Ophthalmic |
PCR tube | Thermo Scientific | AB-0622 | For GRIN lens implantation |
Pinch Clamp | World Precision Instrument | 14040 | For clamping the tubing |
Polytetrafluoroethylene (PTFE) tape | TegaSeal PTFE Tape | A-A-58092 | For fastening miniScope to the base |
Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | For preparing aCSF |
Robotic arm | NIDA/IRP | Custom-designed | For GRIN lens implantation |
Saline | Hospira | RL 7302 | For both surgeries |
Set screw | DECORAH LLC. | 3BT-P9005-00-0025 | For screwing the brass hex nut in miniscope base |
Silicone Rubber tubing, 0.062”ID, 1/8”OD | McMaster | 2124T3 | For irrigation of aCSF |
Sodium bicarbonate | Sigma | 144-55-8 | For preparing aCSF |
Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | For preparing aCSF |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | 7558-80-7 | For preparing aCSF |
Stereotaxic stage | KOPF | Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic | For both surgeries |
Sterile cotton swab | Puritan | REF 806-WC | For both surgeries |
Surgical tools | Fine Science tools | 11251-35 | For surgeries |
Suture | Sofsilk | REF SS683 | For virus injection |
Syringe filter (0.22 µm) | Millex | SLGVR33RS | For filtering aCSF during GRIN lens implantation |
Viral suspension (AAV1-CamKII-GCamp6f) | Addgene | 100834-AAV1 | For virus injection |
Titre: 2.8 X 10^13 GC/ml | |||
Xylazine | VETone | V1 510650 | For GRIN lens implantation |