Stereotaxische virale injectie en gradiënt-index lensimplantatie voor diepe hersenen in vivo calciumbeeldvorming

Het experimentele protocol volgt de richtlijnen voor dierverzorging van de Universiteit van Wyoming. De muis die in deze studie wordt gebruikt, is 6 maanden oud mannelijk C57BL / 6J. De procedure kan worden gebruikt om zich te richten op diepe hersengebieden voor in vivo calciumbeeldvorming. Hier, ter demonstratie, is het beoogde hersengebied de muis mPFC (voorste en achterste (A / P): 1,94 mm, mediaal en lateraal (M / L): 0,5 mm, dorsaal en ventraal (D / V): 1,8 mm). Dit protocol is aangepast op basis van het eerder gepubliceerde protocol21. 1. Stereotaxische injectie van virus in de mPFC (figuur 1) Voorbereiding op de operatie Steriliseer alle chirurgische instrumenten met behulp van een autoclaaf en plaats ze over een steriel oppervlak. Bereid een spuit van 10 μL door deze te primen met zoutoplossing en voor te vullen met 5 μL zoutoplossing. Bevestig de spuit aan een micropomp (zie Materiaaltabel). Zet het verwarmingskussen aan en houd de temperatuur op 35 °C. Plaats de muis in de inductiekamer (5″ x 10″ x 4″, lengte x breedte x hoogte) met 5% isofluraan en 1 l/min zuurstofdebiet. Let goed op en tel de ademhalingsfrequentie van de muis. Haal de muis eruit zodra de ademhalingsfrequentie afneemt tot 1 ademhaling(en).OPMERKING: De ademhalingssnelheid van de muis kan gemakkelijk worden gecontroleerd door tijdens elke inademing naar beneden en naar boven van de rugspierbeweging te kijken. Laat de muis zich nestelen op een benchtop die gescheiden is van het operatiegebied. Scheer met een scheerknipper het haar af van de muizenkop tot aan de eerste halswervels. Plaats de muis op het stereotaxische podium (zie Materiaaltabel) en zet de positie vast met oorstaven en neusklem. Handhaaf de isofluraanstroom naar het stereotaxische stadium op 1,5% isofluraan en 0,5 l/min zuurstofdebiet. Breng de smerende oogzalf op beide ogen aan met een schoon wattenstaafje om uitdroging van de ogen tijdens de operatie te voorkomen. Beoordeel pedaalreflexen op de muis om te bevestigen dat de muis volledig is verdoofd voordat de operatie wordt gestart. Desinfecteer het haarloze gebied met 7,5% povidon-jodiumoplossing (zie Tabel met materialen) en 70% ethanol driemaal elk met behulp van steriele wattenstaafjes. Injecteer een klein volume (50 μL) van 2% lidocaïne onder de huid van het haarloze gebied. Maak een incisie van 2 cm door de huid langs de middellijn met behulp van een scalpel om de lambda en bregma van de schedel bloot te leggen. Verwijder de fascia van de schedel met behulp van droge wattenstaafjes en puntige tang. Nadat de bregma en lambda zichtbaar zijn, gebruikt u de punt van een boorboor (0,5 mm in diameter) om de Z-coördinaten van bregma en lambda te meten (zie Tabel met materialen). Pas de hoogte van de neushouder aan totdat de bregma en lambda op dezelfde Z-positie liggen. Plaats de 0,5 mm tandboorbraam in een positie van A/P: 1,94 mm, M/L: 0,5 mm van de bregma. Boor door de schedel.OPMERKING: Hier, voor demonstratie, is het beoogde hersengebied de muis mPFC. Dit protocol kan worden gebruikt om elk ander diep hersengebied te targeten. Als het beoogde hersengebied bijvoorbeeld de Nucleus Accumbens (NAc) is, moet de overeenkomstige positie A / P zijn: 0,9 mm, M / L: 1, 2 mm. Verwijder de dura met een naaldpunt van 30 G en reinig alle stukjes botresten met een scherpe tang van 45°.OPMERKING: Bloedingen komen vaak voor omdat kleine bloedvaten kunnen worden gescheurd tijdens de reinigingsstap. Gebruik steriele wattenstaafjes om het bloeden te stoppen en breng zoutoplossing aan om het gebied te wassen. Breng zoutoplossing aan op het blootgestelde schedelgebied om het vochtig te houden. Plaats het virus in de microliterspuit met behulp van het bedieningspaneel van de micropomp. Trek 500 nL luchtbel op, gevolgd door 800 nL van het virus bij een stroomsnelheid van 50 nL/s.OPMERKING: Voor het demonstratiedoel wordt hier een adeno-geassocieerd virus serotype 1 (AAV1) dat GCaMP6f (een GECI), AAV1-CamKII-GCamp6f, tot expressie brengt, geïnjecteerd in de mPFC (zie Tabel met materialen). De titer van het virus is 2,8 x 1013 GC/ml. Het is 1:2 verdund in zoutoplossing vóór injectie. Plaats de punt van de naald op de bovenkant van de bregma om de bregma aan te raken en noteer de Z-coördinaat van bregma. Beweeg de naald boven het geboorde gat en injecteer 100 nL van het virus om ervoor te zorgen dat de naald niet verstopt is. Beweeg de naald langzaam naar beneden in het hersenweefsel naar de beoogde Z-coördinaat van D/V: 1,75 mm en beweeg deze vervolgens licht omhoog naar de Z-coördinaat van D/V: 1,65 mm.OPMERKING: Dit is om een kleine zak te maken voor de virale oplossing die moet worden toegediend. Als het beoogde hersengebied de NAc is, moet de overeenkomstige gerichte Z-coördinaat van D / V 4,2 mm zijn en vervolgens licht bewegen tot 4,1 mm. Gebruik het bedieningspaneel om de micropomp in te stellen op het injecteren van 500 nL van het virus met een stroomsnelheid van 50 nL/min. Druk op de KNOP RUN op het bedieningspaneel om het virus te injecteren.OPMERKING: Injectie duurt ongeveer 10 minuten. Nadat de injectie voorbij is, wacht u nog eens 5-10 minuten voordat u de naald uit de hersenen haalt. Breng regelmatig zoutoplossing aan om het blootgestelde schedelgebied vochtig te houden tijdens de injectieperiode. Beweeg de naald omhoog en uit de hersenen. Injecteer tweemaal 500 nL volume bij een debiet van 50 nL/s.OPMERKING: Deze stap bevestigt dat een goed volume van het virus in de hersenen is toegediend. Tijdens de eerste 500 nL-injecties komt het virus vrij, gevolgd door luchtbellen. Tijdens de tweede injectie van 500 nL verschijnen eerst luchtbellen, gevolgd door zoutoplossing. De spuit is nu klaar om het virus te laden voor de volgende muis. Zodra de operatie is voltooid, worden de microliterspuit en naald grondig gereinigd met aceton gevolgd door zoutoplossing. Lijn de huidranden uit en sluit de incisie voorzichtig af met een hechting (maat 4.0). Breng antibiotische zalf aan op het gestikte gebied om infectie te voorkomen. Verwijder de muis uit het stereotaxische podium en breng hem terug naar zijn thuiskooi. Plaats de thuiskooi in een couveuse van 33 °C totdat de muis ambulant is.OPMERKING: Het duurt meestal 10-15 minuten voordat een muis wakker wordt uit isofluraan-anesthesie voordat deze begint te bewegen. Nadat de muis begint te bewegen, dient u niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen toe gedurende 3 postoperatieve dagen (zie Tabel met materialen). Laat de muis 14 dagen herstellen van de operatie voordat u grin-lensimplantatie uitvoert. 2. GRIJNSlensimplantatie in de mPFC (figuur 1) Voorbereiding op de operatie Bereid het kunstmatige hersenvocht (ACSF) voor dat 124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1,2 mM MgCl2, 25 mM glucose, 26 mM NaHCO3 en 2,4 mM CaCl2 bevat. Steriliseer alle chirurgische instrumenten met behulp van een autoclaaf en plaats ze over een steriel oppervlak. Zet het verwarmingskussen aan en houd de temperatuur op 35 °C. Smelt 1% Agarose en bewaar het in een waterbad bij 42 °C tot gebruik.OPMERKING: De gesmolten agarose kan een paar uur in het waterbad worden bewaard. Desinfecteer een GRIN-lens (1 mm diameter, 4,38 mm lang, figuur 2A) gedurende 15 minuten in 70% ethanol, breng deze over in een buis gevuld met zoutoplossing om deze goed te spoelen voordat deze wordt geïmplanteerd.OPMERKING: GRIN-lenzen (zie Materiaaltabel) worden geproduceerd via zilver- en lithium-ionuitwisseling in speciale glazen, waardoor ze niet-toxisch en neuronvriendelijkzijn 6,7. Veel in de handel verkrijgbare GRIN-lenzen kunnen echter toxische residuen uitlogen, waardoor neurodegeneratie ontstaat, waardoor ze ongeschikt zijn voor implantatie in de levende hersenen voor langdurige in vivo beeldvormingsstudies. Deze GRIN-lenzen moeten mogelijk worden gecoat met biocompatibele middelen zoals paryleen-C om toxische bijwerkingen op naburige neuronen te voorkomen22. Weeg de muis en verdoof deze door een intraperitoneale injectie van ketamine / xylazinemengsel (zie tabel met materialen) (Ketamine: 100 mg / kg; Xylazine: 15 mg/kg).OPMERKING: Een muis met een gewicht van 30 g vereist 300 μL Ketamine/Xylazine mengsel (Ketamine 100 mg/ml en Xylazine 1,5 mg/ml) voor de aanvangsdosis en 150 μL Ketamine (10 mg/ml) voor extra doses tijdens de operatie. Om de muis tijdens het hele chirurgische proces verdoofd te houden, moeten extra doses Ketamine (50 mg / kg) ten minste eenmaal per uur worden toegediend. Het anesthesiestadium van de muis moet regelmatig worden gecontroleerd door pedaalreflexen te beoordelen. Scheer het haar van het operatiegebied met een scheerapparaat en reinig het haar met een natte papieren handdoek. Plaats de muis in het stereotaxische stadium en zet de positie vast door de neusklem en oorstaven aan te spannen. Breng smerende oogzalf aan op beide ogen met een steriel wattenstaafje. Controleer of de muis volledig is verdoofd door pedaalreflexen te beoordelen. Desinfecteer het haarloze gebied met 7,5% povidon-jodiumoplossing en 70% ethanol drie keer elk met behulp van steriele wattenstaafjes. Dien 2 mg/kg Dexamethason intramusculair toe in de dij om het risico op operatiegerelateerde zwelling en ontsteking te verlagen. Injecteer 50 μL 2% lidocaïne onder de huid van het operatiegebied. Gebruik een fijne schaar om een driehoekig huidgebied van 1,5 cm (hoogte) x 1,0 cm (basis) af te snijden, van de voorste kant tussen de ogen tot de achterste kant achter de lambda. Verwijder het botvliesweefsel uit de schedel met behulp van een fijne tang, micromes en wattenstaafjes.OPMERKING: De schedel moet grondig worden gereinigd en gedroogd voordat u de volgende stap zet. Breng cyanoacrylaat (zie Materiaaltabel) aan op de randen van de huid en bevestig de huid aan de schedel. Wacht 5 minuten tot het cyanoacrylaat droogt. Met behulp van een boorpunt van 0,5 mm lijnt u de bregma en lambda in hetzelfde horizontale vlak uit door de hoogte van de neusklem aan te passen. Lokaliseer een boorboor (1,2 mm in diameter) op een positie van A/P: 1,94 mm, M/L: 0,8 mm van de bregma. Boor door de schedel. Verwijder de dura met een naaldpunt van 30 G en reinig alle stukjes botresten met een scherpe tang van 45°.OPMERKING: Dit botresten kunnen de volgende aspiratiestap blokkeren als ze niet volledig worden verwijderd. Bevestig een handmatig gepolijste naald met een stomp uiteinde van 27 G (figuur 2B) aan de naaldhouder die is gekoppeld aan een robotarm die onder een hoek van 10° is gekanteld (figuur 2C). Sluit het andere uiteinde van de naaldhouder aan op het huisstofzuigersysteem.OPMERKING: De robotarm (zie Tabel met materialen) is ontwikkeld door de groep van Dr. Lin bij de NIDA/IRP en wordt bestuurd door een op maat ontwikkelde, momenteel open-access software, AutoStereota (https://github.com/liang-bo/AutoStereota)23 Lokaliseer de punt van de naald om de bregma aan te raken. Stel de Z-coördinaat van bregma in op 0 door op de bregmaknop op AutoStereota te klikken. Stel de Input X-waarde in op 0,8, de Input Y-waarde op 1,94, de Input Z-waarde op 1,0 en klik vervolgens op de knop Zoeken om de naald naar de bovenkant van het geboorde gat op de schedel te verplaatsen. Pas de positie van de naald aan het midden van het blootgestelde hersenweefselgebied aan via AutoStereota.OPMERKING: Om de naald in laterale of mediale richtingen te bewegen, voert u de stapwaarde in en klikt u op de laterale of mediale knoppen op AutoStereota. Evenzo, om de naald in voorste of achterste en dorsale of ventrale richtingen te bewegen, klikt u respectievelijk op Rostral of Caudal en Dorsal of Ventrale knoppen. Schakel het vacuüm in en begin met het spoelen van het blootgestelde hersengebied met ACSF via een zwaartekrachtgestuurd buizensysteem (zie Materiaaltabel) dat is verbonden met een naald van 30 G met een gebogen punt. ACSF wordt continu gebbeld met een gasmengsel van 95% O2 en 5% CO2 en gefilterd door een filter van 0,2 μm.OPMERKING: Het ACSF-debiet is ~ 1,5 ml / min. De uitgangsdruk van het gasmengsel wordt op ~3 psi gehouden. Zuig hersenweefsel laag voor laag op met behulp van AutoStereota-software (Figuur 3).OPMERKING: Aspiratie van hersenweefsel wordt in 4 ronden voltooid, zodat een kolomzak (1,8 mm diep en 1 mm in diameter) wordt gegenereerd.Klik in de “zStep” -sessie op en controleer de eerste en tweede rij. Stel de waarden voor de eerste rij in op 0,2 en 1. Stel de waarden voor de tweede rij in op 0,15 en 4 (figuur 3A). Stel in de sessie “Mode” naaldgrootte 27 Gauge en 1.2 in, stel Dims 0.9 in. Alle andere waarden gebruiken standaardwaarden (figuur 3A). Klik achtereenvolgens op de knoppen Instellen, Nul behouden en Starten om de aspiratie te starten.OPMERKING: Dit is de1e ronde van aspiratie. Invoerwaarden geven aan dat de aspiratiediepte 0,2 mm is (van de Z-coördinaat van 0) tijdens de eerste stap met 1 laag; tijdens de tweede stap is de aspiratiediepte 0, 15 mm, continu herhaald gedurende 4 lagen. De aspiratieresolutie is 1,2 en de diameter is 0,9 mm. Tijdens het aspirateren kan de directe locatie van de naaldpunt worden bewaakt via het track graph-paneel. Na het voltooien van deze aspiratieronde wordt een kolomvak met 0,8 mm diepte en 1 mm diameter gegenereerd. De naaldpunt komt terug naar het midden met de Z-coördinaat van 0. Klik in de “zStep” -sessie op en controleer de eerste en tweede rij. Stel de waarden voor de eerste rij in op 1 en 1. Stel de waarden voor de tweede rij in op 0,15 en 4 (figuur 3B). Houd in de sessie “Modus” alle waarden hetzelfde als de vorige ronde (figuur 3B). Klik achtereenvolgens op de knoppen Instellen, Nul behouden en Starten om de aspiratie te starten.OPMERKING: Dit is de2e ronde van aspiratie. Invoerwaarden geven aan dat de aspiratiediepte 1 mm is (van de Z-coördinaat van 0) tijdens de eerste stap met 1 laag; tijdens de tweede stap is de aspiratiediepte 0, 15 mm, continu herhaald gedurende 4 lagen. Na het voltooien van deze aspiratieronde wordt het kolomvak met 1,6 mm diepte en 1 mm diameter gegenereerd. Klik in de “zStep” -sessie en controleer alleen de eerste rij. Stel de waarden voor de eerste rij in op 1,8 en 1 (figuur 3C). Stel in de sessie “Modus” naaldgrootte 27 Gauge en 2.2 in. Alle andere waarden blijven gelijk aan die van de vorige ronde (figuur 3C). Klik achtereenvolgens op de knoppen Instellen, Nul behouden en Starten om de aspiratie te starten.OPMERKING: Dit is de3e ronde van aspiratie. Ingangswaarden geven aan dat de aspiratiediepte 1,8 mm is (vanaf de Z-coördinaat van 0) met 1 laag. De aspiratieresolutie is 2.2. Na het voltooien van deze aspiratieronde wordt het kolomvak met 1,8 mm diepte en 1 mm diameter gegenereerd. Klik in de “zStep” -sessie en controleer alleen de eerste rij. Stel de waarden voor de eerste rij in op 1,6 en 1 (afbeelding 3D). Stel in de sessie “Modus” naaldgrootte 27 Gauge en 2.2 in, stel Dims 0.6 in (Figuur 3D). Klik achtereenvolgens op de knoppen Instellen, Nul behouden en Starten om de aspiratie te starten.OPMERKING: Dit is de4e ronde van aspiratie. Het doel van deze stap is om bloed dat zich in de zak heeft opgehoopt op te ruimen. Bloedingen komen vaak voor als kleine bloedvaten worden gescheurd tijdens het aspiratieproces. Om het bloed grondig te reinigen, stopt u de irrigatie van ACSF gedurende 5 minuten en schakelt u de irrigatie vervolgens weer in. Herhaal de4e aspiratieronde meerdere keren totdat de pocket bloedvrij is. Dit protocol kan worden gebruikt om andere diepe hersengebieden te targeten. Als het beoogde hersengebied bijvoorbeeld de NAc is, moet de uiteindelijke overeenkomstige Z-coördinaat van D/V 4,4 mm zijn. Stop het vacuüm en de irrigatie van ACSF. Breng de naald op +2 mm Z-coördinaat en 0,5 mm vooraan naar het midden. Plaats de steriele 1mm GRIN lens in de zak. Houd de punt van de naald in contact met de belichte GRIN-lens om ervoor te zorgen dat de GRIN-lens in een hoek van 10° wordt geplaatst. Druk voorzichtig op het bovenoppervlak van de GRIN-lens met steriel zacht tissuepapier om ervoor te zorgen dat het onderste oppervlak van de GRIN-lens in contact komt met het hersenweefsel. Breng de gesmolten Agarose aan in de opening tussen de GRIN-lens en het hersenweefsel met behulp van een spatel. Nadat Agarose een gel heeft gevormd, verwijdert u overtollige Agarose met behulp van een microblad. Reinig de schedel grondig met zoutoplossing en wattenstaafjes. Laat de schedel drogen voordat het tandcement (zie Tabel met materialen) wordt aangebracht. Haal het mengputje uit -20 °C vriezer. Meng het tandcementpoeder en de katalysatorvloeistof en breng een laag zelfuithardend kleefharscement aan op de schedel; omring eerst de GRIN-lens en bedek vervolgens de hele blootgestelde schedel. Wacht 5 minuten en laat het volledig uitharden. Verwijder de aspiratienaald voorzichtig. Meng in een schone plastic put tandcementpoeder, zwarte houtskool met vloeistof en breng een dunne laag van het mengsel aan op de 1e laag tandcement. Wacht 5 minuten om het te laten uitharden. Bescherm de blootgestelde GRIN-lens door deze te bedekken met een aangepaste dop gemaakt van een PCR-buis (figuur 2D). Breng cyanoacrylaat aan om de dop aan het tandcement te bevestigen. Injecteer 1 ml voorverwarmde zoutoplossing subcutaan in de muis, gevolgd door 0,1 mg/kg buprenorfine. Plaats de muis terug in zijn thuiskooi. Plaats de thuiskooi in een incubator van 33 °C en controleer de muis totdat deze ambulant is. Het duurt meestal 20-40 minuten voordat een muis wakker wordt uit anesthesie voordat hij begint te bewegen. Dien niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen toe en controleer de muis gedurende ten minste 3 postoperatieve dagen. Laat de muis 30 dagen herstellen van de operatie. 3. Aanbrengen van de miniscopehouder (basis) op de schedel van de muis (figuur 1) Verdoof de muis in een inductiekamer met 5% isofluraan en 1 l/min zuurstofstroomsnelheid totdat de ademhalingsfrequentie afneemt tot 1 ademhaling(en). Plaats de muis in het stereotaxische stadium en zet de positie vast met oorstaven en neusklemmen. Zorg voor een continue stroom van isofluraan (1,5%) en zuurstof (0,5 l/min). Breng oogheelkundige zalf aan op zijn ogen om ze vochtig te houden. Zet het verwarmingskussen aan en houd de temperatuur op 35 °C. Controleer of de muis volledig is verdoofd door pedaalreflexen te beoordelen. Verwijder de dop die de GRIN-lens bedekt voorzichtig met een puntige tang. Boor de gedroogde cyanoacrylaatresten van het tandcement volledig af met behulp van een microdrill (zie Tabel met materialen). Knip het haar rond het tandheelkundige cementgebied met een kleine schaar. Reinig het vuil met behulp van een persluchtstofzuiger. Gebruik een met aceton gedoopt wattenstaafje om het bovenoppervlak van de GRIN-lens schoon te maken. Bereid de miniscoop voor met de houder (basis). Plaats een zeskantmoer van #00-90 (zie Materiaaltabel) in de sleuf in de basis en breng cyanoacrylaat aan om het daar vast te zetten (figuur 2E). Breng een polytetrafluorethyleen (PTFE) tape strak aan rond de draad van de miniscoop en knip de extra tape af (figuur 2F). Bevestig de miniscoop aan de basis en gebruik de borgschroef om de miniscoop aan de basis te bevestigen (figuur 2G). Sluit de miniscoop aan op de kabel en schakel de op maat ontwikkelde, momenteel open-access software NeuView in (zie Materiaaltabel).OPMERKING: NeuView-software is op maat ontwikkeld voor miniscoop in vivo calciumbeeldvorming van dr. Lin’s groep op de NIDA / IRP 7,12. Het is open access (https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0). Klik in NeuView op Hardware, vink LED1 aan en klik op de knop Streamen om de livebeelden weer te geven (afbeelding 4A). Om live streaming te stoppen, klikt u op stop knop. Plaats de miniscoop in een op maat gemaakte miniscoop-houder (figuur 2H) waarvan de XYZ-positie kan worden gemanipuleerd met behulp van gemotoriseerde controllers (figuur 2I). Plaats de miniscoop net boven de belichte GRIN-lens en maak deze evenwijdig aan het oppervlak van de lens. Breng de miniscoop langzaam naar beneden in de richting van de GRIN-lens en pas de Z-positie aan totdat het beste scherpstelvlak is gevonden.OPMERKING: Het beste brandpuntsvlak wordt bepaald door verschillende mogelijke Z-posities te vergelijken en het brandpuntsvlak te selecteren met een duidelijke visualisatie van de meeste cellichamen. Breng de eerste laag tandcement voorzichtig aan rond de miniscoopbasis zonder de positie van de miniscoop te wijzigen. Nadat het cement is uitgehard, verwijdert u voorzichtig de houdarm zodat de miniscoop op zichzelf op de muiskop kan staan.OPMERKING: Het tandcement heeft de neiging om te krimpen na het uitharden en het zal de miniscoop wegslepen van het oorspronkelijke focusvlak. Meestal wordt de positie van de miniscoop Z iets boven het oorspronkelijke brandpuntsvlak getild voordat tandcement wordt aangebracht om de potentiële verandering te compenseren. Breng een tweede laag tandcement aan rond de basis om alle gaten te vullen en ervoor te zorgen dat er geen LED-licht uit de openingen lekt. Laat het tandcement uitharden. Verwijder de muis uit het stereotaxische stadium. Maak de borgschroef los en maak de miniscoop los van de basis. Plaats een 3D-geprinte beschermkap in de basis om de blootgestelde GRIN-lens te beschermen en draai de borgschroef in de basis vast (figuur 2J). Plaats de muis terug in zijn thuiskooi.OPMERKING: Het duurt meestal 10-15 minuten voordat een muis wakker wordt uit isofluraan-anesthesie voordat deze begint te bewegen. 4. Miniscope montage en in vivo Ca2+ beeldvorming (Figuur 1) Monteer de miniscoop aan de basis Verdoof de muis kort in de inductiekamer (5% isofluraan en 1 l/min zuurstofstroomsnelheid). Plaats de muis op een schoon bankoppervlak. Maak de borgschroef los met een kleine schroevendraaier, verwijder de beschermkap en reinig het oppervlak van de GRIN-lens met een met aceton doordrenkt wattenstaafje. Wikkel een PTFE-tape strak om de miniscoopdraad en bevestig de miniscoop aan de basis op de muiskop. Sluit de miniscope aan op de kabel (Figuur 2K), schakel de NeuView-software in. Klik in NeuView op Hardware, vink LED1 aan en klik op de knop Streamen om de livebeelden weer te geven (afbeelding 4A). Identificeer het beste brandpuntsvlak door de positie van de miniscoop ten opzichte van de basis aan te passen, iets aan te spannen of los te maken met behulp van een stompe tang.OPMERKING: Het beste brandpuntsvlak wordt bepaald door verschillende mogelijke locaties te vergelijken en degene te selecteren met een duidelijke visualisatie van de meeste cellichamen. Draai de borgschroef vast en plaats de muis terug in zijn thuiskooi. Pas in NeuView het LED-lichtvermogen aan op het optimale niveau. Klik op Vastleggen en vervolgens op Trigger-knoppen om de opname te starten en druk op Stoppen na 150 frames.OPMERKING: Het laagst mogelijke vermogen bepaalt het optimale niveau van het LED-vermogen voor het bereiken van een helder genoeg beeld. Het doel van het opnemen van een korte video is om het identificeren van hetzelfde brandpuntsvlak in de toekomst te vergemakkelijken voor repetitieve beeldvorming. Koppel de kabel los van de miniscope. Laat de muis ten minste 30 minuten herstellen voordat u het experiment start.OPMERKING: Om de miniscoop te beschermen, worden meestal de waterfles en de draadvoeding gedurende deze korte periode verwijderd. Als de muis langer in zijn thuiskooi moet blijven, wordt het aanbevolen om in de handel verkrijgbare dieetgel (zie Tabel met materialen) in de thuiskooi te leveren. Data-acquisitie voor in vivo calciumbeeldvormingOPMERKING: In vivo calcium Imaging kan tegelijkertijd worden uitgevoerd samen met alle gedragstests die de onderzoeker wenst. Voor het demonstratiedoel is het voorbeeld hier in vivo Ca2+ beeldvorming tijdens een open veldtest. Om dit doel te bereiken, zijn twee computers nodig. Eén computer is uitgerust met commerciële software (zie Tabel met materialen) om een camera te bedienen om het gedrag van muizen automatisch vast te leggen. De andere computer is uitgerust met NeuView om de miniscoop te bedienen en de Ca2+ beelden op te nemen. Schakel de gedragscamerasoftware in (zie Tabel met materialen) om de arena voor muisgedrag te bekijken via een livestreamfunctie. Pas handmatig de scherpstelling van de bovenste camera aan (figuur 2L). Selecteer Trigger/Strobe en vink “Enable/disable trigger” (Figuur 4B) aan. Klik op de knop Opnemen , gebruik Bladeren om de locatie te selecteren waar gedragsopnamen worden opgeslagen, selecteer de gewenste afbeeldingsindeling.OPMERKING: De functie “Trigger Control” is ingeschakeld om de gedragsregistratie te activeren door de NeuView-software, zodat de gedragsframes en de bijbehorende calciumbeeldvormingsframes tijdelijk aan elkaar worden gekoppeld. De gedragsregistratie kan in elk gewenst formaat worden opgeslagen. Gedragsregistratie wordt over het algemeen opgeslagen in JPEG-indeling in de aangewezen map. Breng de muis dicht bij de arena en sluit de miniscoop aan op de kabel die is gekoppeld aan het Data Acquisition System (figuur 2L) (zie Materiaaltabel). De muis wordt vervolgens in het midden van de arena geplaatst. Met de Livestream-functie van NeuView-software kunt u het LED-vermogen aanpassen om de helderheid van het calciumbeeld te optimaliseren.OPMERKING: Voor calciumbeeldvorming is de opnameframesnelheid standaard 10 frames / s. Schakel in NeuView LED1 uit, klik op Vastleggen en vervolgens op Trigger-knoppen om de opname te starten en druk op Stoppen na 100 frames.OPMERKING: Dit is om achtergrondafbeeldingen op te nemen voor ongeveer 100 frames met LED-licht uit. Klik in de software voor gedragscamera’s op Opname starten (afbeelding 4C). Controleer in NeuView LED1, klik op Vastleggen en vervolgens op Trigger-knoppen om de opname te starten. Druk op Stoppen na 3000 frames.OPMERKING: Dit is om calciumbeeldvorming en gedrag tegelijkertijd vast te leggen. De open-veldtest is 15 minuten lang, meestal onderverdeeld in drie opnamesessies van elk 5 minuten. Dit om te voorkomen dat de miniscoop oververhit raakt door continu gebruik. Sla zowel de calciumbeeldvorming als gedragsregistraties op in de aangewezen mappen. Herhaal de opname nog twee sessies terwijl u de achtergrond voor elke sessie opneemt en sla alle opnamen op in de aangewezen map. Maak de miniscoop los van de basis. Nadat de opname is voltooid, koppelt u de kabel los van de miniscoop. Verdoof de muis kort in de inductiekamer (5% isofluraan en 1L/min zuurstofstroomsnelheid). Plaats de muis op een schoon, warm oppervlak. Schroef de borgschroef in de basis los en maak de miniscoop los van de basis. Plaats de beschermkap terug over de basis en draai de borgschroef vast. Zet de muis terug in zijn thuiskooi.