Miniscope in vivo calcium imaging è una potente tecnica per studiare le dinamiche neuronali e i microcircuiti in topi che si comportano liberamente. Questo protocollo descrive l’esecuzione di interventi chirurgici al cervello per ottenere una buona imaging del calcio in vivo utilizzando un miniscopio.
Un microscopio a fluorescenza in miniatura (miniscopio) è un potente strumento per l’imaging del calcio in vivo da animali che si comportano liberamente. Offre diversi vantaggi rispetto ai tradizionali sistemi di imaging del calcio multi-fotone: (1) compatto; (2) leggero; (3) a prezzi accessibili; e (4) consente la registrazione da animali che si comportano liberamente. Questo protocollo descrive gli interventi chirurgici cerebrali per l’imaging del calcio in vivo del cervello profondo utilizzando un sistema di registrazione miniscopio sviluppato su misura. La procedura di preparazione consiste in tre fasi, tra cui (1) iniezione stereotassica del virus nella regione cerebrale desiderata di un cervello di topo per etichettare uno specifico sottogruppo di neuroni con sensore di calcio geneticamente codificato; (2) impianto di lenti a gradiente(GRIN) in grado di trasmettere l’immagine del calcio dalla regione profonda del cervello al sistema miniscopio; e (3) apporre il supporto del miniscopio sul cranio del mouse dove il miniscopio può essere collegato in seguito. Per eseguire l’imaging del calcio in vivo , il miniscopio viene fissato sul supporto e le immagini di calcio neuronale vengono raccolte insieme a registrazioni simultanee del comportamento. L’attuale protocollo chirurgico è compatibile con qualsiasi sistema di imaging a singolo fotone e due fotoni commerciale o personalizzato per l’imaging del calcio in vivo nel cervello profondo.
La segnalazione intracellulare di Ca2+ è un regolatore essenziale della crescita cellulare, proliferazione, differenziazione, migrazione, trascrizione genica, secrezione e apoptosi1. Nei neuroni, la segnalazione di Ca2+ è controllata con precisione poiché il suo modello spazio-temporale è correlato a funzioni cruciali come l’eccitabilità della membrana, il rilascio di neurotrasmettitori e la plasticità sinaptica2.
L’imaging del calcio in vivo è una potente tecnica che può essere utilizzata per decodificare la rappresentazione del circuito neurale elementare ai normali comportamenti animali, identificare attività neuronali aberranti in modelli animali di disturbi cerebrali e svelare potenziali bersagli terapeutici che possono normalizzare questi circuiti alterati. I due comuni sistemi di imaging del calcio in vivo sono la microscopia a fluorescenza a scansione laser a due fotoni 3,4,5,6 e la microscopia miniaturizzata montata sulla testa (miniscopio)7,8,9,10,11,12,13 . La microscopia convenzionale a due fotoni offre vantaggi impressionanti come una migliore risoluzione, un rumore inferiore e un minore fotosbiancamento; tuttavia, gli animali da esperimento devono essere fissati a testa in giù, limitando gli studi comportamentali che possono essere eseguiti 3,4,5,6. Al contrario, il sistema miniscopio montato sulla testa è piccolo e portatile, rendendo possibile studiare un’ampia varietà di test comportamentali utilizzando animali che si comportano liberamente 7,8,9,10,11,12,13.
Esistono due indicatori principali di Ca2+, indicatori chimici 5,14 e indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI)15,16. L’imaging Ca2+ è stato facilitato utilizzando GECI altamente sensibili forniti con vettori virali che consentono l’etichettatura specifica dei neuroni nel circuito mirato. Il continuo sforzo per migliorare la sensibilità, la longevità e la capacità di etichettare anche i compartimenti subcellulari, rende i GECI ideali per vari studi di imaging del calcio in vivo 17,18,19.
La dispersione della luce nel tessuto cerebrale durante l’imaging limita la penetrazione ottica in profondità, anche con la microscopia a due fotoni. Tuttavia, la lente Gradient Index (GRIN) supera questo problema in quanto la lente GRIN può essere incorporata direttamente nei tessuti biologici e trasmettere immagini dalla regione profonda del cervello all’obiettivo del microscopio. A differenza dell’obiettivo convenzionale realizzato in materiale otticamente omogeneo e richiede una superficie sagomata complicata per mettere a fuoco e creare immagini, le prestazioni dell’obiettivo GRIN si basano su un graduale cambiamento dell’indice di rifrazione all’interno del materiale dell’obiettivo che raggiunge la messa a fuoco con una superficiepiana 20. L’obiettivo GRIN può essere fabbricato fino a 0,2 mm di diametro. Pertanto, una lente GRIN miniaturizzata può essere impiantata nel cervello profondo senza causare troppi danni.
In questo articolo, viene presentato un protocollo chirurgico completo per l’imaging del calcio in vivo nel cervello profondo. A scopo dimostrativo, descriviamo gli interventi chirurgici al cervello specificamente mirati alla corteccia prefrontale mediale (mPFC) del cervello del topo e la registrazione dell’imaging del calcio in vivo tramite un sistema miniscopio personalizzato sviluppato dal gruppo del Dr. Lin presso il National Institute on Drug Abuse (NIDA / IRP) 7,12. La procedura sperimentale prevede due importanti interventi chirurgici al cervello. Il primo intervento chirurgico consiste nell’iniezione stereotassica di un vettore virale che esprime GCaMP6f (un GECI) nella mPFC. Il secondo intervento chirurgico consiste nell’impiantare la lente GRIN nella stessa regione del cervello. Dopo il recupero da questi interventi chirurgici al cervello, la procedura successiva consiste nell’apporre il supporto del miniscopio (base) sul cranio del topo usando cemento dentale. In vivo L’imaging Ca2+ può essere eseguito in qualsiasi momento dopo aver montato il miniscopio sulla sua base. Il protocollo chirurgico per l’iniezione virale e l’impianto di lenti GRIN è compatibile con qualsiasi sistema di imaging a singolo fotone e due fotoni commerciale o personalizzato per l’imaging di calcio in vivo nel cervello profondo.
Una domanda centrale nelle neuroscienze è capire come le dinamiche neurali e i circuiti codificano e memorizzano le informazioni e come vengono alterate nelle malattie del cervello. Utilizzando un miniscopio in vivo Ca2+ sistema di imaging, l’attività neurale individuale di diverse centinaia di neuroni all’interno di un microcircuito locale può essere monitorata simultaneamente da un animale che si comporta liberamente. Qui, viene descritto un protocollo chirurgico dettagliato per l’iniezione virale e l’impianto di lenti GRIN per preparare i roditori per un cervello profondo in vivo Ca2+ imaging tramite un sistema di registrazione miniscopio sviluppato su misura. La tabella 1 mostra i confronti del nostro sistema miniscopio con altri sistemi miniscopi disponibili in commercio e personalizzati 7,8,9,10,11,13,25,26. Vale la pena notare che l’impianto di lenti GRIN utilizzando l’attuale protocollo chirurgico è compatibile con qualsiasi sistema di imaging a singolo fotone e due fotoni commerciale o personalizzato per un’imaging di calcio in vivo nel cervello profondo.
Dall’iniezione virale all’acquisizione dei dati del miniscopio in vivo per l’imaging del calcio, l’intera procedura sperimentale richiede almeno 2 mesi per essere completata. È un processo complicato e laborioso. Il successo finale dell’esperimento dipende da molteplici fattori, tra cui la corretta scelta dei GECI, l’iniezione di virus con precisione nell’area cerebrale mirata, una sufficiente espressione virale nella popolazione neurale desiderata, l’impianto della lente GRIN esattamente nella posizione desiderata, un adeguato recupero dagli interventi chirurgici, nonché se si verifica una grave infiammazione post-operatoria e se il comportamento dell’animale è gravemente influenzato dagli interventi chirurgici, E così via.
Due passaggi critici includono l’iniezione stereotassica del virus e l’impianto della lente GRIN. A scopo dimostrativo, la microiniezione stereotassica è stata eseguita nel mPFC del topo, con il virus adeno-associato (AAV1) che codifica GCaMP6f sotto il controllo del promotore CaMKII che etichetta selettivamente i neuroni piramidali nell’mPFC. GCaMP6f è stato scelto in quanto è uno degli indicatori di calcio più veloci e sensibili con un tempo di semidecosio di 71 ms15. Inoltre, l’espressione virale AAV di GCaMP6f è di lunga durata (cioè diversi mesi), rendendolo ideale per eseguire immagini ripetitive in vivo Ca2+ per un lungo periodo per studi longitudinali in modelli murini di malattie neurodegenerative27. L’attuale protocollo chirurgico può essere adattato per colpire diverse popolazioni cellulari in qualsiasi altra regione del cervello. Vari strumenti virali disponibili consentono l’etichettatura selettiva di specifiche popolazioni neurali nella regione del cervello desiderata all’età desiderata. Inoltre, i ricercatori possono sfruttare il sistema di ricombinazione Cre-LoxP e vari modelli murini transgenici disponibili per effettuare modifiche genetiche e studiare l’esito dei circuiti comportamentali e neurali28,29.
Una caratteristica unica del protocollo presentato è che l’aspirazione automatizzata del tessuto cerebrale strato per strato è stata eseguita prima dell’impianto della lente GRIN (1 mm di diametro). Ciò si ottiene attraverso un ago da 27 G collegato a un sistema di vuoto, controllato da un braccio robotico personalizzato e dal software23. Sulla base della nostra esperienza, questo metodo genera una superficie uniforme per il contatto della lente GRIN e provoca meno danni al tessuto vicino rispetto all’aspirazione manuale del tessuto23. Per questo motivo, questa procedura porta un ovvio vantaggio per le lenti GRIN con un diametro relativamente più ampio (ad esempio, 1 mm). Tuttavia, l’aspirazione del tessuto potrebbe non essere necessaria per impiantare una lente GRIN con un diametro inferiore (0,5 mm o 0,25 mm). Invece, può essere piantato direttamente lungo il binario principale realizzato con un ago 30 G21.
Oltre ai due passaggi critici discussi sopra, molti altri fattori devono essere attentamente considerati per un’operazione di successo. (1) Tutti gli strumenti che contattano il cervello devono essere sterilizzati per prevenire l’infezione. (2) Tutte le fasi chirurgiche devono essere eseguite per ridurre al minimo i danni al cervello per prevenire ulteriori infiammazioni e formazione eccessiva di tessuto cicatriziale. (3) Le dosi di anestesia somministrate inizialmente e mantenute durante l’intervento chirurgico, in particolare quelle somministrate per via intraperitoneale, devono essere attentamente considerate. Le dosi di anestesia possono essere modificate in base a diversi ceppi di topo, in quanto alcuni possono essere più suscettibili. (4) La condizione del topo deve essere costantemente monitorata durante l’intervento chirurgico. Infine, (5) i topi devono essere regolarmente monitorati dopo l’intervento chirurgico, poiché molte complicazioni possono verificarsi dopo l’intervento chirurgico.
Sebbene un pezzo di tessuto cerebrale venga rimosso unilateralmente durante la fase di impianto della lente GRIN, non abbiamo osservato alcun deficit comportamentale evidente 7,12. Il peso del miniscopio è di circa 2 grammi e il cavo è progettato su misura per renderlo leggero e per garantire che il mouse possa facilmente trasportarlo. Il miniscopio e il cavo sono collegati all’animale solo prima dell’imaging in vivo e staccati dopo l’imaging. L’intero processo di imaging di solito non richiede più di 30 minuti. Pertanto, queste strumentazioni non impediscono al mouse di comportarsi liberamente. Le fasi di installazione e disinstallazione del miniscopio richiedono una breve anestesia (meno di 2 minuti) con isoflurano ai fini del contenimento degli animali. In genere lasciamo che il topo si riprenda dalla breve esposizione di isoflurano per 30 minuti prima di eseguire l’imaging in vivo. Abbiamo eseguito miniscope in vivo calcium imaging una volta alla settimana per alcune settimane senza notare alcun impatto sulla salute del topo e sul comportamento sociale del topo12.
Una delle principali limitazioni dell’attuale sistema di registrazione del miniscopio è la necessità di collegare il microscopio a un cavo per l’acquisizione dei dati. La presenza del cavo a volte limita le prestazioni del compito del mouse e limita la registrazione di un animale alla volta. Recentemente, è stato sviluppato un miniscopio wireless25,26. Ciò amplierà le prestazioni del compito e consentirà l’imaging simultaneo in vivo da più animali in un gruppo. Inoltre, lo sviluppo di GECI più sensibili con lunghezze d’onda separabili spettralmente combinate con un miniscopio a doppio colore offrirà possibilità più interessanti per la ricerca neuroscientifica.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è supportato da sovvenzioni del National Institute of Health (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 e UG3NS115608.
0.6mm and 1.2mm drill burrs | KF technology | 8000037800 | For craniotomy |
27-G and 30-G needle | BD PrecisionGlide Needle | REF 305109 and REF305106 | For both surgeries |
45 angled forceps | Fine Science tools | 11251-35 | For surgeries |
7.5% povidone-iodine solution (Betadine) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-151-17 | Surface disinfectant |
Acetone | Sigma-Aldrich | 179124-1L | GRIN lens cleaner |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539-25G | For GRIN lens implantation |
Antibiotic ointment | HeliDerm Technology | 81073087 | For virus injection |
Anti-inflamatory drug (Ibuprofen) | Johnson & Johnson Consumer Inc | 30043308 | Acts as pain killer after surgeries |
AutoStereota | NIDA/IRP | github.com/liang-bo/autostereota | For GRIN lens implantation |
Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2) | Point Grey | Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C | For recording behavior |
Brass hex nut | McMASTER-CARR | 92736A112 | For GRIN lens implantation |
Buprenorphine | Par Pharmaceuticals | NDC 4202317905 | For GRIN lens implantation |
Calcium chloride | Sigma | 10043-52-4 | For preparing aCSF |
Commutator | NIDA/IRP | Custom-designed | Component of image acquisition system |
Compressed Oxygen and Caxbondioxide tank | Rocky Mountain Air Solutions | BI-OX-CD5C-K | For GRIN lens implantation |
Compressed Oxygen tank | Rocky Mountain Air Solutions | OX-M-K | For virus injection |
Cordless Microdrill | KF technology | 8000037800 | For craniotomy |
Cyanoacrylate | Henkel Coorporation | # 1811182 | For GRIN lens implantation |
Data acquisition controller | NIDA/IRP | Custom-designed | Component of image acquisition system |
Data transmission cable | NIDA/IRP | Custom-designed | Component of image acquisition system |
Dental cement set | C&B Metabond and Catalyst | A00253revA306 and A00168revB306 | For GRIN lens implantation |
Dental cement set | Duralay | 2249D | For GRIN lens implantation |
Dexamethasone | VETone | NDC 1398503702 | For GRIN lens implantation |
Dextrose | Sigma | 50-99-7 | For preparing aCSF |
Diet gel | Clear H20 | 72-06-5022 | Diet Supplement for mouse |
GRIN lens | GRINTECH | NEM-100-25-10-860-S | For GRIN lens implantation |
Heating Pad | Physitemp Instruments LLC. | #10023 | To keep the mouse body warm during surgeries |
Isoflurane | VETone | V1 502017 | Anesthesia |
Ketamine | VETone | V1 501072 | For GRIN lens implantation |
Lidocaine | WEST-WARD | NDC 0143-9575-01 | Local anesthesia |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | 7791-18-6 | For preparing aCSF |
Microliter syringe (Hamilton) | Hamilton | 7653-01 | For virus injection |
MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instrument | #178647 | For virus injection |
Miniscope | NIDA/IRP | Custom-designed | For imaging |
Miniscope base | Protolabs | Custom-designed | For mounting the base |
Miniscope holding arm | NIDA/IRP | Custom-designed | For mounting the base |
Miniscope protection cap | Protolabs | Custom-designed | For protecting the miniscope |
Motorized controller | Thorlabs | KMTS50E | For mounting the base |
NeuView | NIDA/IRP | https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0 | For in vivo imaging |
Ophthalmic ointment | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | Ophthalmic |
PCR tube | Thermo Scientific | AB-0622 | For GRIN lens implantation |
Pinch Clamp | World Precision Instrument | 14040 | For clamping the tubing |
Polytetrafluoroethylene (PTFE) tape | TegaSeal PTFE Tape | A-A-58092 | For fastening miniScope to the base |
Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | For preparing aCSF |
Robotic arm | NIDA/IRP | Custom-designed | For GRIN lens implantation |
Saline | Hospira | RL 7302 | For both surgeries |
Set screw | DECORAH LLC. | 3BT-P9005-00-0025 | For screwing the brass hex nut in miniscope base |
Silicone Rubber tubing, 0.062”ID, 1/8”OD | McMaster | 2124T3 | For irrigation of aCSF |
Sodium bicarbonate | Sigma | 144-55-8 | For preparing aCSF |
Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | For preparing aCSF |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | 7558-80-7 | For preparing aCSF |
Stereotaxic stage | KOPF | Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic | For both surgeries |
Sterile cotton swab | Puritan | REF 806-WC | For both surgeries |
Surgical tools | Fine Science tools | 11251-35 | For surgeries |
Suture | Sofsilk | REF SS683 | For virus injection |
Syringe filter (0.22 µm) | Millex | SLGVR33RS | For filtering aCSF during GRIN lens implantation |
Viral suspension (AAV1-CamKII-GCamp6f) | Addgene | 100834-AAV1 | For virus injection |
Titre: 2.8 X 10^13 GC/ml | |||
Xylazine | VETone | V1 510650 | For GRIN lens implantation |