生体 内 カルシウムイメージングのための定位ウイルス注入および勾配指数レンズ移植

実験プロトコルは、ワイオミング大学の動物ケアガイドラインに従っています。本研究で用いたマウスは生後6ヶ月のオスC57BL/6Jである。この手順は、 in vivo カルシウムイメージングのために任意の脳深部領域を標的とするために使用することができる。ここで、実証のために、標的脳領域はマウスmPFC(前部および後部(A/P):1.94mm、内側および側方(M/L):0.5mm、背側および腹側(D/V):1.8mm)である。このプロトコルは、以前に公開されたプロトコル21に基づいて修正される。 1. mPFCへのウイルスの定位注射(図1) 手術の準備 オートクレーブを使用してすべての手術器具を滅菌し、滅菌表面上に置きます。 10 μLのシリンジを生理食塩水でプライミングし、5 μLの生理食塩水で予備充填して準備します。シリンジをマイクロポンプに取り付けます( 材料表を参照)。 加熱パッドの電源を入れ、温度を35°Cに保ちます。 マウスを誘導チャンバー(5インチ x 10インチ x 4インチ、長さ x 幅 x 高さ)に5%のイソフルランと1 L/分の酸素流量で配置します。マウスの呼吸数を注意深く見てカウントします。マウスの呼吸数が1呼吸/秒に減少したら、マウスを取り出します。注:マウスの呼吸数は、各吸入中の背中筋の動きの下向きおよび上向きを見ることによって容易に監視することができる。 マウスが手術領域から分離されたベンチトップ領域に落ち着くのを待ちます。シェービングバリカンで、マウスの頭から最初の頸椎まで髪を剃ります。 マウスを定位ステージ( 材料表を参照)にセットし、イヤーバーとノーズクリップでマウスの位置を固定します。定位段階までのイソフルラン流量を1.5%のイソフルランと0.5L/分の酸素流量に維持します。 手術中の目の乾燥を防ぐために、清潔な綿棒で両目に潤滑眼軟膏を塗布してください。手術を開始する前に、マウスのペダル反射を評価して、マウスが完全に麻酔されていることを確認します。 無毛領域を7.5%ポビドンヨウ素溶液( 材料表を参照)と70%エタノールで滅菌綿棒を使用してそれぞれ3回消毒する。 無毛領域の皮膚の下に少量(50μL)の2%リドカインを注入する。 メスを使用して正中線に沿って皮膚を2cm切開し、頭蓋骨のラムダとブレグマを露出させます。 乾いた綿棒と尖った鉗子の助けを借りて頭蓋骨から筋膜を取り除きます。 ブレグマとラムダが見えたら、デンタルドリルバリ(直径0.5mm)の先端を使用して、ブレグマとラムダのZ座標を測定します( 材料表を参照)。ブレグマとラムダが同じZ位置になるまでノーズホルダーの高さを調整します。 0.5 mmの歯科用ドリルバリを、ブレグマからA/P:1.94 mm、M/L:0.5 mmの位置に見つけます。頭蓋骨をドリルスルーします。注:ここでは、デモンストレーションのために、標的脳領域はマウスmPFCである。このプロトコルは、他の任意の深部脳領域を標的とするために使用することができる。例えば、標的となる脳領域が側坐核(NAc)である場合、対応する位置はA / P:0.9 mm、M / L:1.2 mmでなければなりません。 30Gの針先を使用して硬膜を取り除き、45°の角度の鋭い鉗子を使用してすべての骨破片をきれいにします。注:洗浄ステップ中に小さな血管が破裂する可能性があるため、出血は一般的です。滅菌綿棒を使用して出血を止め、生理食塩水を塗布してその領域を洗ってください。露出した頭蓋骨領域に生理食塩水を塗布して、湿った状態に保ちます。 マイクロポンプのコントロールパネルを使用して、ウイルスをマイクロリットルのシリンジにロードします。500 nLの気泡を引き出し、続いて50 nL/sの流量で800 nLのウイルスを抜き取ります。注:ここでは、実証の目的で、GCaMP6f(GECI)を発現するアデノ随伴ウイルス血清型1(AAV1)、AAV1-CamKII-GCamp6fをmPFCに注入する( 材料表参照)。ウイルスの力価は2.8 x 1013 GC/ mLである。注射前に生理食塩水で1:2希釈する。 ブレグマに触れるだけに針の先端をブレグマの上に置き、ブレグマのZ座標を書き留めます。ドリルで開けた穴の上に針を動かし、100 nLのウイルスを注入して、針が詰まらないようにします。 針をゆっくりと脳組織に下ろし、目標とするD/VのZ座標(1.75 mm)まで移動し、その後、D/VのZ座標(1.65 mm)までわずかに移動させます。注:これは、ウイルス溶液を注入するための小さなポケットを作成するためです。標的脳領域がNAcの場合、D/Vの対応する標的Z座標は4.2mmでなければならず、その後4.1mmまでわずかに移動する。 コントロールパネルを使用して、マイクロポンプを50 nL/minの流量で500 nLのウイルスを注入するように設定します。コントロールパネルの RUN ボタンを押してウイルスを注入します。注:注射には約10分かかります。注射が終わったら、さらに5〜10分待ってから脳から針を取り出します。注射期間中、露出した頭蓋骨領域を湿らせておくために生理食塩水を頻繁に塗布してください。 針を上下に動かし、脳から出ます。500 nL/sの流量で500 nLの容量を2回注入します。注:このステップは、適切な量のウイルスが脳に投与されたことを確認します。最初の500nL注射の間に、ウイルスが放出され、続いて気泡が放出される。2回目の500nL注入では、気泡が最初に現れ、続いて生理食塩水が現れる。これで、シリンジは次のマウスにウイルスをロードする準備が整いました。手術が完了したら、マイクロリットルの注射器と針をアセトンで徹底的に洗浄し、続いて生理食塩水で洗浄します。 皮膚の端を整列させ、縫合糸(サイズ4.0)で切開部を慎重に閉じます。感染を防ぐために縫合された領域に抗生物質軟膏を塗布する。 マウスを定位ステージから取り外し、ホームケージに戻します。マウスが歩行可能になるまで、ホームケージを33°Cのインキュベーターに入れます。注:マウスが動き始める前に、イソフルラン麻酔から目を覚ますのに通常10〜15分かかります。 マウスが動き回った後、非ステロイド性抗炎症薬を術後3日間投与する( 材料表を参照)。マウスを手術から14日間回復させてから、GRINレンズ移植を追求します。 2. mPFCにおけるGRINレンズ注入(図1) 手術の準備 124 mM の NaCl、2.5 mM の KCl、1.25 mM の NaH2 PO 4、1.2 mM の MgCl 2、25 mM のグルコース、26 mM の NaHCO3、および 2.4 mM の CaCl 2を含む人工脳脊髄液 (ACSF) を準備します。 オートクレーブを使用してすべての手術器具を滅菌し、滅菌表面上に置きます。 加熱パッドの電源を入れ、温度を35°Cに保ちます。 1%アガロースを溶かし、使用時まで42°Cの水浴中に保管する。注:溶けたアガロースは、数時間水浴中に保管することができます。 GRINレンズ(直径1mm、長さ4.38mm、 図2A)を70%エタノールで15分間消毒し、生理食塩水で満たされたチューブに移して適切にすすぎ、移植する前に適切にすすいでください。注:GRINレンズ(材料表を参照)は、特殊なメガネで銀とリチウムイオン交換を介して製造され、無毒でニューロンに優しい6,7。しかし、多くの市販のGRINレンズは、毒性残留物を浸出させて神経変性を引き起こす可能性があり、長期間のin vivoイメージング研究のための生きた脳への移植には適していません。これらのGRINレンズは、隣接するニューロン22に対する毒性副作用を防止するために、パリレン−Cのような生体適合性薬剤によるコーティングを必要とし得る。 マウスの体重を量り、ケタミン/キシラジン混合物の腹腔内注射( 材料表を参照)(ケタミン:100mg / kg;キシラジン:15ミリグラム/ kg)。注:体重30gのマウスは、初期用量に300μLのケタミン/キシラジン混合物(ケタミン100mg / mLおよびキシラジン1.5mg / mL)を必要とし、手術中の追加用量に150μLのケタミン(10mg / mL)を必要とする。外科的プロセス全体を通してマウスを麻酔状態に保つためには、ケタミン(50mg / kg)の追加用量を少なくとも1時間に1回投与する必要がある。マウスの麻酔段階は、ペダル反射を評価することによって頻繁に監視される必要がある。 シェーバーで手術部位の毛を剃り落とし、濡れたペーパータオルで髪を拭きます。 マウスを定位ステージに置き、ノーズクリップとイヤーバーを締めてマウスの位置を固定します。滅菌綿棒で両目に潤滑眼眼軟膏を塗布する。ペダル反射を評価して、マウスが完全に麻酔されていることを確認します。 無毛領域を7.5%ポビドンヨウ素溶液と70%エタノールで滅菌綿棒を使用してそれぞれ3回消毒する。2mg/kgのデキサメタゾンを大腿部に筋肉内に投与し、手術関連の腫れや炎症のリスクを低くします。 手術領域の皮膚の下に50μLの2%リドカインを注入する。 細かいはさみを使用して、1.5 cm(高さ)x 1.0 cm(ベース)の三角形の皮膚領域を、目の間の前側からラムダの後ろの後側まで切り取ります。 細かい鉗子、マイクロブレード、綿棒を使用して頭蓋骨から骨膜組織を取り除きます。注:頭蓋骨は、次のステップに進む前に徹底的に洗浄し、乾燥させる必要があります。 シアノアクリレート( 材料表を参照)を皮膚の縁に塗布し、皮膚を頭蓋骨に取り付ける。シアノアクリレートが乾くまで5分間待ちます。 0.5 mmのドリルバリチップを使用して、ノーズクリップの高さを調整して、ブレグマとラムダを同じ水平面に合わせます。 歯科用ドリルバリ(直径1.2 mm)をブレグマからA/P:1.94 mm、M/L:0.8 mmの位置に置きます。頭蓋骨をドリルスルーします。30Gの針先を使用して硬膜を取り除き、45°の角度の鋭い鉗子を使用してすべての骨破片をきれいにします。注:この骨の破片は、完全に除去されない場合、後続の吸引ステップを妨げる可能性があります。 手動で研磨した27Gの鈍い端の針(図2B)を、10°の角度で傾けたロボットアームに結合された針ホルダーに取り付けます(図2C)。ニードルホルダーのもう一方の端を家の真空システムに接続します。注:ロボットアーム(材料表を参照)は、NIDA/IRPのリン博士のグループによって開発され、カスタム開発され、現在オープンアクセスのソフトウェアであるAutoStereota(https://github.com/liang-bo/AutoStereota)23によって制御されます。 ブレグマに触れるだけの針の先端を見つけます。ブレグマのZ座標を0に設定するには、オートステレオタの ブレグマ ボタンをクリックします。 入力 X 値を 0.8、入力 Y 値を 1.94、入力 Z 値を 1.0 に設定し、[検索] ボタンをクリックして、頭蓋骨のドリル穴の上部に針を移動します。 オートステレオタ を介して 露出した脳組織領域の中心に針の位置を調整します。メモ: 針を横方向または内側方向に動かすには、ステップ値を入力し、 AutoStereota の横方向 または 内側 ボタンをクリックします。同様に、針を前または後、背側または腹側の方向に動かすには、それぞれ 吻 側または 尾 側および 背側 または 腹側の ボタンをクリックします。 真空をオンにし、先端が曲がった30G針に接続された重力制御チューブシステム( 材料表を参照)を介して、露出した脳領域をACSFですすぎ始めます。ACSFは、95%O2と5%CO2 の混合ガスで連続的にバブリングされ、 0.2μmのフィルターでろ過されます。注: ACSF 流量は ~ 1.5 mL/分です。混合ガスの出力圧力は〜3psiに保たれる。 AutoStereotaソフトウェアの助けを借りて、脳組織を層ごとに吸引する(図3).注:脳組織の吸引は4ラウンドで完了し、カラムポケット(深さ1.8mm、直径1mm)が生成されます。「zStep」セッションで、1行目と2行目をクリックして確認します。最初の行の値を 0.2 と 1 に設定します。2 行目の値を 0.15 と 4 に設定します (図 3A)。 「モード」セッションで、 ニードルサイズ を27ゲージと1.2に設定し、 ディムを 0.9に設定します。他のすべての値はデフォルト値を使用します(図3A)。 「設定」、「ゼロを保持」、「開始」ボタンを順にクリックして、吸引を開始します。注:これは願望の第 1ラウンドです。入力値は、吸引深さが 1 層の最初のステップで 0.2 mm (Z 座標 0 から) であることを示します。第2ステップの間、吸引深さは0.15mmであり、4層にわたって連続的に繰り返される。吸引分解能は1.2で、直径は0.9mmです。吸引中、針先の瞬間的な位置は、トラックグラフパネルを介して監視することができます。この吸引ラウンドを完了すると、深さ0.8mm、直径1mmのカラムポケットが生成されます。針先は Z 座標が 0 の中央に戻ります。 「zStep」セッションで、1行目と2行目をクリックして確認します。最初の行の値を 1 と 1 に設定します。2 行目の値を 0.15 と 4 に設定します (図 3B)。 「Mode」セッションでは、すべての値を前のラウンドと同じに保ちます(図3B)。 「設定」、「ゼロを保持」、「開始」ボタンを順にクリックして、吸引を開始します。注:これは願望の第2ラウンドです 。入力値は、吸引深さが 1 層の最初のステップで (Z 座標 0 から) 1 mm であることを示します。第2ステップの間、吸引深さは0.15mmであり、4層にわたって連続的に繰り返される。この吸引ラウンドを完了すると、深さ1.6mm、直径1mmのカラムポケットが生成されます。 「zStep」セッションでは、最初の行のみをクリックしてチェックします。最初の行の値を 1.8 と 1 に設定します (図 3C)。 「モード」セッションで、 ニードルサイズを 27ゲージと2.2に設定します。他のすべての値は、前のラウンドの値と同じままです(図3C)。 「設定」、「ゼロを保持」、「開始」ボタンを順にクリックして、吸引を開始します。注:これは願望の第3ラウンドです 。入力値は、吸引深さが 1.8 mm (Z 座標 0 から) で 1 層であることを示します。吸引分解能は2.2です。この吸引ラウンドが完了すると、深さ1.8mm、直径1mmのカラムポケットが生成されます。 「zStep」セッションでは、最初の行のみをクリックしてチェックします。最初の行の値を 1.6 と 1 に設定します (図 3D)。 「モード」セッションで、 ニードルサイズ を27ゲージ、2.2を設定し、 ディムを 0.6に設定します(図3D)。 「設定」、「ゼロを保持」、「開始」ボタンを順にクリックして、吸引を開始します。注:これは願望の第4ラウンドです 。このステップの目的は、ポケットに蓄積された血液をきれいにすることです。出血は、吸引プロセス中に小さな血管が破裂するため一般的です。血液を完全にきれいにするには、ACSFの灌漑を5分間停止してから、再び灌漑をオンにします。ポケットが無血になるまで、4回目の 吸引を複数回繰り返します。このプロトコルは、他の深部脳領域を標的とするために使用することができる。たとえば、標的となる脳領域がNAcの場合、D/Vの最終的な対応するZ座標は4.4mmでなければなりません。 ACSFの真空と灌漑を停止します。針を Z 座標 +2 mm、中心より 0.5 mm 前方にします。滅菌済みの1mm GRINレンズをポケットに入れます。 針の先端を露出したGRINレンズに接触させ、GRINレンズが10°の角度に収まるようにします。GRINレンズの上面を滅菌軟部組織紙で優しく押して、GRINレンズの下面が脳組織に接触していることを確認します。 ヘラの助けを借りて、GRINレンズと脳組織の隙間に溶けたアガロースを塗布します。アガロースがゲルを形成した後、マイクロブレードを用いて余分なアガロースを除去する。 生理食塩水と綿棒で頭蓋骨を徹底的にきれいにしてください。その後の歯科用セメント( 材料表を参照)を塗布する前に頭蓋骨を乾燥させる。 -20°Cの冷凍庫からよく混ぜたものを取り出す。歯科用セメント粉末と触媒液を混合し、頭蓋骨に自己硬化型接着レジンセメントの層を塗布する。まず、GRINレンズを囲み、露出した頭蓋骨全体を覆います。 5分間待ってから、完全に硬化します。吸引針を慎重に外します。 きれいなプラスチック井戸で、歯科用セメント粉末、黒い木炭を液体と混合し、歯科用セメントの第1層の上に混合物の薄層を塗布する。それが固まるまで5分待ちます。 露出したGRINレンズをPCRチューブで作られたカスタマイズされたキャップで覆って保護します(図2D)。シアノアクリレートを塗布してキャップを歯科用セメントに取り付けます。 予め温めた生理食塩水1mLをマウスの皮下に注射し、続いて0.1mg/kgのブプレノルフィンを注入する。マウスをホームケージに戻します。ホームケージを33°Cのインキュベーターに入れ、マウスが歩行可能になるまでマウスを監視します。マウスが動き始める前に麻酔から目を覚ますのに通常20〜40分かかります。 非ステロイド性抗炎症薬を投与し、少なくとも3回手術後数日間マウスを監視する。マウスを手術から30日間回復させます。 3. マウスの頭蓋骨にミニスコープホルダー(ベース)を取り付ける(図1) マウスを5%のイソフルランと1 L/分の酸素流量で誘導チャンバーに入れ、呼吸数が1呼吸/秒に減少するまで麻酔します。 マウスを定位ステージに置き、イヤーバーとノーズクリップでマウスの位置を固定します。イソフルラン(1.5%)と酸素(0.5 L/分)の連続的な流れを維持します。 眼科用軟膏をその目に塗布して、それらを湿らせておく。加熱パッドの電源を入れ、温度を35°Cに保ちます。 ペダル反射を評価して、マウスが完全に麻酔されていることを確認します。 GRINレンズを覆っているキャップを尖った鉗子を使ってそっと外します。マイクロドリルを使用して、歯科用セメントから乾燥シアノアクリレート残渣を完全にドリルオフします( 材料表を参照)。 小さなはさみで歯科用セメント部分の周りの髪をカットします。圧縮空気ダスターの助けを借りて破片をきれいにしてください。アセトンに浸した綿棒を使用して、GRINレンズの上面を清掃します。 ミニスコープをホルダー(ベース)で準備します。 #00-90六角ナット( 材料表を参照)をベースにあるスロットに入れ、シアノアクリレートを塗布してそこに固定します(図2E)。 ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)テープをミニスコープのネジの周りにしっかりと巻き付け、余分なテープを切り取ります(図2F)。 ミニスコープをベースに固定し、ロックネジを使用してミニスコープをベースに固定します(図2G)。 ミニスコープをケーブルに接続し、カスタム開発の現在オープンアクセスのソフトウェアであるNeuViewをオンにします( 材料表を参照)。注:NeuViewソフトウェアは、NIDA/IRP 7,12のリン博士のグループによるミニスコープの生体内カルシウムイメージング用にカスタム開発されています。オープンアクセス(https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0)です。 NeuViewで、[ ハードウェア]をクリックし、 LED1をチェックし、[ ストリーム] ボタンをクリックしてライブ画像を表示します(図4A)。ライブストリーミングを停止するには、[ 停止 ]ボタンをクリックします。 ミニスコープを、電動コントローラを使用してXYZ位置を操作できるカスタムメイドのミニスコープ保持アーム(図2H)にセットします(図2I)。 露出したGRINレンズのすぐ上にあるミニスコープの位置を確認し、レンズの表面に平行にします。ミニスコープをGRINレンズに向かってゆっくりと下ろし、最適な焦点面が見つかるまでZ位置を調整します。注: 最適な焦点面は、いくつかの可能な Z 位置を比較し、ほとんどの細胞体を明確に視覚化して焦点面を選択することによって決定されます。 ミニスコープの位置を変えずに、ミニスコープベースの周りに歯科用セメントの最初の層を慎重に塗布します。セメントが固まったら、ミニスコープがマウスヘッドの上に自立できるように、保持アームを静かに取り外します。注:歯科用セメントは硬化後に収縮する傾向があり、ミニスコープを元の焦点面から引きずり下ろします。通常、ミニスコープのZ位置は、潜在的な変化を補償するために歯科用セメントを塗布する前に、元の焦点面よりわずかに持ち上げられる。 ベースの周りに歯科用セメントの第2層を塗布して、すべての隙間を埋め、隙間からLEDライトが漏れていないことを確認します。歯科用セメントを硬化させます。 マウスを定位ステージから取り外します。ロックネジを緩め、ミニスコープをベースから取り外します。3Dプリントされた保護キャップをベースに入れて、露出したGRINレンズを保護し、ベースのロックネジを締めます(図2J)。 マウスをホームケージに戻します。注:マウスが動き始める前に、イソフルラン麻酔から目を覚ますのに通常10〜15分かかります。 4. ミニスコープの取り付けと生体内Ca2+イメージング(図1) ミニスコープをベースに取り付けます。 マウスを誘導チャンバー内で短時間麻酔する(5%イソフルランおよび1L/分の酸素流量)。マウスをクリーンベンチの上に置きます。 小さなドライバーでロックネジを緩め、保護キャップを外し、アセトンを浸した綿棒でGRINレンズの表面を拭きます。 PTFE テープをミニスコープのネジにしっかりと巻き付け、ミニスコープをマウスヘッドのベースに固定します。 ミニスコープをケーブルに接続し(図2K)、NeuViewソフトウェアの電源を入れます。 NeuViewで、[ ハードウェア]をクリックし、 LED1をチェックし、[ ストリーム] ボタンをクリックしてライブ画像を表示します(図4A)。 ベースに対するミニスコープの位置を調整して、鈍い鉗子の助けを借りてわずかに締め付けたり緩めたりして、最適な焦点面を特定します。注: 最適な焦点面は、いくつかの可能な位置を比較し、ほとんどの細胞体を明確に視覚化した場所を選択することによって決定されます。 ロックネジを締め、マウスをホームケージに戻します。 NeuView で、LED ライトの電力を最適なレベルに調整します。[ キャプチャ ]ボタンをクリックし、[ トリガー] ボタンをクリックして録画を開始し、150フレーム後に [停止] をクリックします。メモ: 可能な限り低い電力によって、十分に明るい画像を得るための LED 電力の最適なレベルが決まります。短いビデオを録画する目的は、反復的なイメージングのために将来同じ焦点面を識別することを容易にすることである。 ミニスコープからケーブルを外します。実験を開始する前に、マウスを少なくとも30分間回復させます。メモ:ミニスコープを保護するために、通常、ウォーターボトルとワイヤーフードフィーダーは、この短い時間の間に取り外されます。マウスが自宅のケージに長く滞在する必要がある場合は、市販のダイエットゲル( 材料表を参照)をホームケージに供給することをお勧めします。 インビボカルシウムイメージングのためのデータ取得注: インビボ カルシウムイメージングは、研究者が望む行動テストと同時に実施することができます。デモンストレーションの目的で、ここでの例は、オープンフィールドテスト中の in vivo Ca2+ イメージングです。この目標を達成するには、2 台のコンピューターが必要です。1台のコンピュータには、マウスの動作を自動的に記録するようにカメラを制御するための商用ソフトウェア( 材料表を参照)が装備されています。もう1台のコンピュータには、ミニスコープを制御し、Ca2 + 画像を記録するためのNeuViewが装備されています。 ビヘイビアカメラソフトウェア( 材料表を参照)をオンにして、ライブストリーム機能を使用してマウスビヘイビアアリーナを表示します。トップカメラのフォーカスを手動で調整します(図2L)。 トリガー/ストロボを選択し、「トリガーを有効/無効にする」にチェックを入れます(図4B)。[記録]ボタンをクリックし、[参照]を使用して行動記録を保存する場所を選択し、目的の画像形式を選択します。メモ:「トリガ制御」機能を有効にすると、NeuViewソフトウェアによって動作記録がトリガされ、動作フレームと対応するカルシウムイメージングフレームが時間的に結合されます。動作記録は、任意の形式で保存できます。動作の記録は、通常、指定されたフォルダにJPEG形式で保存されます。 マウスをアリーナに近づけ、ミニスコープをデータ集録システムにリンクされているケーブルに接続します(図2L)( 材料表を参照)。その後、マウスはアリーナの中央に配置されます。 NeuViewソフトウェアのライブストリーム機能を使用して、LEDの電力を調整してカルシウム画像の明るさを最適化します。メモ: カルシウムイメージングの場合、記録フレームレートはデフォルトで 10 フレーム/秒です。 NeuViewで、 LED1のチェックを外し、[ キャプチャ ]ボタン、[ トリガー] ボタンをクリックして録音を開始し、100フレーム後に [停止] をクリックします。注:これは、LEDライトをオフにして約100フレームの背景画像を記録することです。 挙動カメラソフトウェアで、[ 録画の開始 ]をクリックします(図4C)。NeuView で LED1 をチェックし、[ キャプチャ] をクリックし、[ トリガー] ボタンをクリックして録音を開始します。3000フレーム後に 停止 を押します。注:これは、カルシウムのイメージングと行動を同時に記録するためです。オープンフィールドテストは15分で、通常は5分間につき3つのレコーディングセッションに分かれています。これは、連続使用によるミニスコープの過熱を防ぐためです。 カルシウムイメージングと行動記録の両方を指定されたフォルダに保存します。各セッションの前に背景を記録しながら、さらに2つのセッションの記録を繰り返し、指定されたフォルダにすべての記録を保存します。 ミニスコープをベースから切り離します。 記録が完了したら、ミニスコープからケーブルを外します。 誘導チャンバー内でマウスを短時間麻酔する(5%イソフルランおよび1L/分の酸素流量)。清潔で暖かい場所にマウスを置きます。 ベースにあるロックネジを外し、ミニスコープをベースから取り外します。保護キャップをベースに戻し、ロックネジを締めます。マウスをホームケージに戻します。