Miniscope in vivo Calcium-Bildgebung ist eine leistungsstarke Technik zur Untersuchung neuronaler Dynamik und Mikroschaltkreise in sich frei verhaltenden Mäusen. Dieses Protokoll beschreibt die Durchführung von Gehirnoperationen, um eine gute In-vivo-Kalziumbildgebung mit einem Miniskop zu erreichen.
Ein Miniatur-Fluoreszenzmikroskop (Miniskop) ist ein wirksames Werkzeug für die In-vivo-Kalziumbildgebung von sich frei verhaltenden Tieren. Es bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Multi-Photonen-Calcium-Bildgebungssystemen: (1) kompakt; (2) leichtgewichtig; (3) erschwinglich; und (4) ermöglicht die Aufzeichnung von sich frei verhaltenden Tieren. Dieses Protokoll beschreibt Gehirnoperationen für die Deep-Brain-in-vivo-Kalziumbildgebung unter Verwendung eines speziell entwickelten Miniscope-Aufzeichnungssystems. Das Präparationsverfahren besteht aus drei Schritten, einschließlich (1) der stereotaktischen Injektion des Virus in die gewünschte Hirnregion eines Mausgehirns, um eine bestimmte Untergruppe von Neuronen mit einem genetisch kodierten Calciumsensor zu kennzeichnen; (2) Implantation einer GRIN-Linse (Gradient-Index), die Kalziumbild von der tiefen Hirnregion an das Miniscope-System weiterleiten kann; und (3) den Miniscope-Halter über dem Mausschädel anbringen, an dem das Miniscope später befestigt werden kann. Um eine In-vivo-Kalziumbildgebung durchzuführen, wird das Miniscope am Halter befestigt und neuronale Kalziumbilder werden zusammen mit gleichzeitigen Verhaltensaufzeichnungen gesammelt. Das vorliegende Operationsprotokoll ist mit allen kommerziellen oder kundenspezifischen Einzelphotonen- und Zwei-Photonen-Bildgebungssystemen für die In-vivo-Kalziumbildgebung des tiefen Gehirns kompatibel.
Die intrazelluläre Ca2 + -Signalgebung ist ein wesentlicher Regulator für Zellwachstum, Proliferation, Differenzierung, Migration, Gentranskription, Sekretion und Apoptose1. In Neuronen wird die Ca2+ -Signalgebung präzise gesteuert, da ihr räumlich-zeitliches Muster mit entscheidenden Funktionen wie der Erregbarkeit der Membran, der Freisetzung von Neurotransmittern und der synaptischen Plastizität2 zusammenhängt.
In vivo Calcium-Bildgebung ist eine leistungsstarke Technik, die verwendet werden kann, um die Repräsentation neuronaler Schaltkreise elementar zu normalem Tierverhalten zu entschlüsseln, abweichende neuronale Aktivitäten in Tiermodellen von Hirnerkrankungen zu identifizieren und potenzielle therapeutische Ziele zu entschlüsseln, die diese veränderten Schaltkreise normalisieren können. Die beiden gängigen In-vivo-Calcium-Bildgebungssysteme sind Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskopie 3,4,5,6 und Head-Mounted-Miniatur-Mikroendoskopie (Miniskop) 7,8,9,10,11,12,13 . Die konventionelle Zwei-Photonen-Mikroskopie bietet entscheidende Vorteile wie bessere Auflösung, geringeres Rauschen und geringeres Photobleichen; Die Versuchstiere müssen jedoch kopffest fixiert werden, was die Verhaltensstudien, die durchgeführt werden können,auf 3,4,5,6 begrenzt. Im Gegensatz dazu ist das am Kopf montierte Miniscope-System klein und tragbar, so dass es möglich ist, eine Vielzahl von Verhaltenstests mit sich frei verhaltenden Tieren 7,8,9,10,11,12,13 zu untersuchen.
Es gibt zwei Ca2+-Frühindikatoren, chemische Indikatoren5,14 und genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECIs) 15,16. Die Ca2+-Bildgebung wurde durch die Verwendung hochempfindlicher GECIs erleichtert, die mit viralen Vektoren geliefert werden, die eine spezifische Markierung von Neuronen im Zielschaltkreis ermöglichen. Die kontinuierlichen Bemühungen, die Empfindlichkeit, Langlebigkeit und Fähigkeit, sogar die subzellulären Kompartimente zu kennzeichnen, zu verbessern, machen GECIs ideal für verschiedene In-vivo-Kalziumbildgebungsstudien 17,18,19.
Die Streuung von Licht im Hirngewebe während der Bildgebung begrenzt die optische Durchdringung in der Tiefe, selbst bei der Zwei-Photonen-Mikroskopie. Die Gradientenindex-Linse (GRIN) überwindet dieses Problem jedoch, da die GRIN-Linse direkt in das biologische Gewebe eingebettet werden kann und Bilder von der tiefen Hirnregion an das Mikroskopobjektiv weiterleitet. Im Gegensatz zu herkömmlichen Linsen aus optisch homogenem Material und einer kompliziert geformten Oberfläche, um zu fokussieren und Bilder zu erzeugen, basiert die GRIN-Linsenleistung auf einer allmählichen Brechungsindexänderung innerhalb des Linsenmaterials, die den Fokus mit einer ebenen Oberfläche20 erreicht. GRIN-Linsen können bis zu einem Durchmesser von 0,2 mm hergestellt werden. Daher kann eine miniaturisierte GRIN-Linse in das tiefe Gehirn implantiert werden, ohne zu viel Schaden anzurichten.
In diesem Artikel wird ein vollständiges Operationsprotokoll für die Deep-Brain-In-vivo-Kalziumbildgebung vorgestellt. Zu diesem Demonstrationszweck beschreiben wir Gehirnoperationen, die speziell auf den medialen präfrontalen Kortex (mPFC) des Mausgehirns abzielen, und die In-vivo-Kalziumbildgebung über ein speziell entwickeltes Miniscope-System, das von Dr. Lins Gruppe am National Institute on Drug Abuse (NIDA / IRP) entwickelt wurde) 7,12. Das experimentelle Verfahren umfasst zwei große Gehirnoperationen. Die erste Operation ist die stereotaktische Injektion eines viralen Vektors, der GCaMP6f (ein GECI) im mPFC exprimiert. Die zweite Operation besteht darin, die GRIN-Linse in die gleiche Gehirnregion zu implantieren. Nach der Genesung von diesen Gehirnoperationen besteht das anschließende Verfahren darin, den Miniscope-Halter (Basis) mit Zahnzement am Mausschädel anzubringen. Im lebenden Organismus Ca2+ Bildgebung kann jederzeit nach der Montage des Miniscopes auf seiner Basis durchgeführt werden. Das Operationsprotokoll für die virale Injektion und die Implantation der GRIN-Linse ist mit allen kommerziellen oder kundenspezifischen Einzelphotonen- und Zwei-Photonen-Bildgebungssystemen für die Calcium-Bildgebung des tiefen Gehirns kompatibel.
Eine zentrale Frage in den Neurowissenschaften ist das Verständnis, wie neuronale Dynamik und Schaltkreise Informationen kodieren und speichern und wie sie bei Gehirnerkrankungen verändert werden. Mit einem Miniscope in vivo Ca2+ Bildgebungssystem kann die individuelle neuronale Aktivität von mehreren hundert Neuronen innerhalb eines lokalen Mikroschaltkreises gleichzeitig von einem sich frei verhaltenden Tier überwacht werden. Hier wird ein detailliertes Operationsprotokoll für die virale Injektion und GRIN-Linsenimplantation beschrieben, um Nagetiere über ein speziell entwickeltes Miniscope-Aufzeichnungssystem auf eine tiefe Gehirn-in-vivo-Ca 2+-Bildgebung vorzubereiten. Tabelle 1 zeigt die Vergleiche unseres Miniscope-Systems mit anderen handelsüblichen und kundenspezifischen Miniscope-Systemen 7,8,9,10,11,13,25,26. Es ist erwähnenswert, dass die GRIN-Linsenimplantation unter Verwendung des vorliegenden chirurgischen Protokolls mit allen kommerziellen oder kundenspezifischen Einzelphotonen- und Zwei-Photonen-Bildgebungssystemen für eine Deep-Brain-In-vivo-Kalziumbildgebung kompatibel ist.
Von der viralen Injektion bis zur Datenerfassung der Miniscope in vivo Calcium-Bildgebung dauert das gesamte experimentelle Verfahren mindestens 2 Monate. Es ist ein komplizierter und arbeitsintensiver Prozess. Der letztendliche Erfolg des Experiments hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich der richtigen Auswahl der GECIs, der genauen Injektion des Virus in den Zielhirnbereich, der ausreichenden Virusexpression in der gewünschten neuronalen Population, der Implantation der GRIN-Linse genau an der gewünschten Stelle, der ausreichenden Erholung von Operationen sowie der Frage, ob nach der Operation eine schwere Entzündung auftritt und ob das Verhalten des Tieres durch Operationen stark beeinträchtigt wird. Und so weiter.
Zwei kritische Schritte umfassen die stereotaktische Injektion von Viren und die Implantation von GRIN-Linsen. Zu diesem Demonstrationszweck wurde die stereotaktische Mikroinjektion in der mPFC der Maus durchgeführt, wobei das Adeno-assoziierte Virus (AAV1) GCaMP6f unter der Kontrolle eines CaMKII-Promotors kodiert, der pyramidale Neuronen im mPFC selektiv markiert. GCaMP6f wurde ausgewählt, da es mit einer halben Zerfallszeit von 71 ms15 einer der schnellsten und empfindlichsten Kalziumindikatoren ist. Darüber hinaus ist die virale AAV-Expression von GCaMP6f lang anhaltend (d. h. mehrere Monate), was sie ideal für die Durchführung repetitiver In-vivo-Ca 2 + –Bildgebung über einen langen Zeitraum für Längsschnittstudien in Mausmodellen neurodegenerativer Erkrankungenist 27. Das aktuelle Operationsprotokoll kann angepasst werden, um verschiedene Zellpopulationen in jeder anderen Gehirnregion anzusprechen. Verschiedene verfügbare virale Werkzeuge ermöglichen die selektive Markierung spezifischer neuronaler Populationen in der gewünschten Hirnregion im gewünschten Alter. Darüber hinaus können Forscher das Cre-LoxP-Rekombinationssystem und verschiedene verfügbare transgene Mausmodelle nutzen, um genetische Modifikationen durchzuführen und das Ergebnis von Verhaltens- und neuronalen Schaltkreisen zu untersuchen28,29.
Ein einzigartiges Merkmal des vorgestellten Protokolls ist, dass die automatisierte Schicht-für-Schicht-Hirngewebeaspiration vor der Implantation der GRIN-Linse (1 mm Durchmesser) durchgeführt wurde. Dies wird durch eine 27-G-Nadel erreicht, die mit einem Vakuumsystem verbunden ist, das von einem speziell angefertigten Roboterarm und der Software23 gesteuert wird. Basierend auf unserer Erfahrung erzeugt diese Methode eine gleichmäßige Oberfläche für den Kontakt mit der GRIN-Linse und verursacht weniger Schäden am benachbarten Gewebe als die manuelle Gewebeaspiration23. Aus diesem Grund bringt dieses Verfahren einen offensichtlichen Vorteil für GRIN-Linsen mit einem relativ breiteren Durchmesser (z. B. 1 mm). Für die Implantation einer GRIN-Linse mit einem kleineren Durchmesser (0,5 mm oder 0,25 mm) ist jedoch möglicherweise keine Gewebeaspiration erforderlich. Stattdessen kann es direkt entlang der führenden Spur mit einer 30 G Nadel21 gepflanzt werden.
Neben den beiden oben besprochenen kritischen Schritten müssen viele weitere Faktoren für eine erfolgreiche Operation sorgfältig abgewogen werden. (1) Alle Instrumente, die das Gehirn berühren, sollten sterilisiert werden, um eine Infektion zu verhindern. (2) Alle chirurgischen Schritte müssen durchgeführt werden, um die Schädigung des Gehirns zu minimieren und weitere Entzündungen und übermäßige Narbengewebebildung zu verhindern. (3) Die Anästhesiedosen, die anfangs verabreicht und während der Operation aufrechterhalten werden, insbesondere diejenigen, die intraperitoneal verabreicht werden, müssen sorgfältig abgewogen werden. Die Anästhesiedosen können je nach Mausstämmen modifiziert werden, da einige anfälliger sein können. (4) Der Zustand der Maus muss während der Operation ständig überwacht werden. Schließlich (5) müssen die Mäuse nach der Operation regelmäßig überwacht werden, da nach der Operation viele Komplikationen auftreten können.
Obwohl während des Implantationsschritts der GRIN-Linse einseitig ein Stück Hirngewebe entfernt wird, haben wir keine offensichtlichen Verhaltensdefizite beobachtet 7,12. Das Gewicht des Miniscopes beträgt etwa 2 Gramm und das Kabel wurde speziell entwickelt, um es leicht zu machen und sicherzustellen, dass die Maus es leicht tragen kann. Das Miniskop und das Kabel werden erst vor der In-vivo-Bildgebung am Tier befestigt und nach der Bildgebung abgelöst. Der gesamte Bildgebungsprozess dauert in der Regel nicht länger als 30 Minuten. Daher hindern diese Instrumentierungen die Maus nicht daran, sich frei zu verhalten. Die Installations- und Deinstallationsschritte des Miniscopes erfordern eine kurze Anästhesie (weniger als 2 Minuten) mit Isofluran zum Zwecke der Tierhaltung. Normalerweise lassen wir die Maus 30 Minuten lang von der kurzen Exposition von Isofluran erholen, bevor wir eine In-vivo-Bildgebung durchführen. Wir haben einige Wochen lang einmal pro Woche eine Miniscope-In-vivo-Kalziumbildgebung durchgeführt, ohne Auswirkungen auf die Gesundheit der Maus und das Sozialverhalten der Maus zu bemerken12.
Eine wesentliche Einschränkung des derzeitigen Miniscope-Aufzeichnungssystems ist die Notwendigkeit, das Mikroskop zur Datenerfassung an ein Kabel anzuschließen. Das Vorhandensein des Kabels schränkt manchmal die Ausführung der Mausaufgabe ein und schränkt die Aufnahme eines Tieres nach dem anderen ein. Vor kurzem wurde ein drahtloses Miniscope entwickelt25,26. Dies erweitert die Aufgabenleistung und ermöglicht die gleichzeitige In-vivo-Bildgebung von mehreren Tieren in einer Gruppe. Darüber hinaus wird die Entwicklung empfindlicherer GECIs mit spektral trennbaren Wellenlängen in Kombination mit einem zweifarbigen Miniscope weitere aufregende Möglichkeiten für die neurowissenschaftliche Forschung bieten.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wird durch Zuschüsse des National Institute of Health (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 und UG3NS115608 unterstützt.
0.6mm and 1.2mm drill burrs | KF technology | 8000037800 | For craniotomy |
27-G and 30-G needle | BD PrecisionGlide Needle | REF 305109 and REF305106 | For both surgeries |
45 angled forceps | Fine Science tools | 11251-35 | For surgeries |
7.5% povidone-iodine solution (Betadine) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-151-17 | Surface disinfectant |
Acetone | Sigma-Aldrich | 179124-1L | GRIN lens cleaner |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539-25G | For GRIN lens implantation |
Antibiotic ointment | HeliDerm Technology | 81073087 | For virus injection |
Anti-inflamatory drug (Ibuprofen) | Johnson & Johnson Consumer Inc | 30043308 | Acts as pain killer after surgeries |
AutoStereota | NIDA/IRP | github.com/liang-bo/autostereota | For GRIN lens implantation |
Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2) | Point Grey | Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C | For recording behavior |
Brass hex nut | McMASTER-CARR | 92736A112 | For GRIN lens implantation |
Buprenorphine | Par Pharmaceuticals | NDC 4202317905 | For GRIN lens implantation |
Calcium chloride | Sigma | 10043-52-4 | For preparing aCSF |
Commutator | NIDA/IRP | Custom-designed | Component of image acquisition system |
Compressed Oxygen and Caxbondioxide tank | Rocky Mountain Air Solutions | BI-OX-CD5C-K | For GRIN lens implantation |
Compressed Oxygen tank | Rocky Mountain Air Solutions | OX-M-K | For virus injection |
Cordless Microdrill | KF technology | 8000037800 | For craniotomy |
Cyanoacrylate | Henkel Coorporation | # 1811182 | For GRIN lens implantation |
Data acquisition controller | NIDA/IRP | Custom-designed | Component of image acquisition system |
Data transmission cable | NIDA/IRP | Custom-designed | Component of image acquisition system |
Dental cement set | C&B Metabond and Catalyst | A00253revA306 and A00168revB306 | For GRIN lens implantation |
Dental cement set | Duralay | 2249D | For GRIN lens implantation |
Dexamethasone | VETone | NDC 1398503702 | For GRIN lens implantation |
Dextrose | Sigma | 50-99-7 | For preparing aCSF |
Diet gel | Clear H20 | 72-06-5022 | Diet Supplement for mouse |
GRIN lens | GRINTECH | NEM-100-25-10-860-S | For GRIN lens implantation |
Heating Pad | Physitemp Instruments LLC. | #10023 | To keep the mouse body warm during surgeries |
Isoflurane | VETone | V1 502017 | Anesthesia |
Ketamine | VETone | V1 501072 | For GRIN lens implantation |
Lidocaine | WEST-WARD | NDC 0143-9575-01 | Local anesthesia |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | 7791-18-6 | For preparing aCSF |
Microliter syringe (Hamilton) | Hamilton | 7653-01 | For virus injection |
MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instrument | #178647 | For virus injection |
Miniscope | NIDA/IRP | Custom-designed | For imaging |
Miniscope base | Protolabs | Custom-designed | For mounting the base |
Miniscope holding arm | NIDA/IRP | Custom-designed | For mounting the base |
Miniscope protection cap | Protolabs | Custom-designed | For protecting the miniscope |
Motorized controller | Thorlabs | KMTS50E | For mounting the base |
NeuView | NIDA/IRP | https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0 | For in vivo imaging |
Ophthalmic ointment | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | Ophthalmic |
PCR tube | Thermo Scientific | AB-0622 | For GRIN lens implantation |
Pinch Clamp | World Precision Instrument | 14040 | For clamping the tubing |
Polytetrafluoroethylene (PTFE) tape | TegaSeal PTFE Tape | A-A-58092 | For fastening miniScope to the base |
Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | For preparing aCSF |
Robotic arm | NIDA/IRP | Custom-designed | For GRIN lens implantation |
Saline | Hospira | RL 7302 | For both surgeries |
Set screw | DECORAH LLC. | 3BT-P9005-00-0025 | For screwing the brass hex nut in miniscope base |
Silicone Rubber tubing, 0.062”ID, 1/8”OD | McMaster | 2124T3 | For irrigation of aCSF |
Sodium bicarbonate | Sigma | 144-55-8 | For preparing aCSF |
Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | For preparing aCSF |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | 7558-80-7 | For preparing aCSF |
Stereotaxic stage | KOPF | Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic | For both surgeries |
Sterile cotton swab | Puritan | REF 806-WC | For both surgeries |
Surgical tools | Fine Science tools | 11251-35 | For surgeries |
Suture | Sofsilk | REF SS683 | For virus injection |
Syringe filter (0.22 µm) | Millex | SLGVR33RS | For filtering aCSF during GRIN lens implantation |
Viral suspension (AAV1-CamKII-GCamp6f) | Addgene | 100834-AAV1 | For virus injection |
Titre: 2.8 X 10^13 GC/ml | |||
Xylazine | VETone | V1 510650 | For GRIN lens implantation |