Inyección viral estereotáxica e implantación de lentes de índice de gradiente para imágenes de calcio in vivo en el cerebro profundo

El protocolo experimental sigue las pautas de cuidado animal de la Universidad de Wyoming. El ratón utilizado en este estudio es un macho de 6 meses de edad C57BL/6J. El procedimiento se puede utilizar para dirigirse a cualquier región profunda del cerebro para imágenes de calcio in vivo . Aquí, para la demostración, el área cerebral objetivo es el mPFC del ratón (anterior y posterior (A / P): 1.94 mm, medial y lateral (M / L): 0.5 mm, dorsal y ventral (D / V): 1.8 mm). Este protocolo se modifica en función del protocolo21 publicado anteriormente. 1. Inyección estereotáxica del virus en el mPFC (Figura 1) Preparación para la cirugía Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos con un autoclave y colocarlos sobre una superficie estéril. Prepare una jeringa de 10 μL cebiéndola con solución salina y prellenándola con 5 μL de solución salina. Conecte la jeringa a una microbomba (consulte la Tabla de materiales). Encienda la almohadilla térmica y mantenga la temperatura a 35 °C. Coloque el ratón en la cámara de inducción (5″ x 10″ x 4″, largo x ancho x alto) con 5% de isoflurano y 1 L/min de caudal de oxígeno. Observe y cuente cuidadosamente la frecuencia respiratoria del ratón. Saque el ratón una vez que su frecuencia respiratoria disminuya a 1 respiración/s.NOTA: La frecuencia respiratoria del ratón se puede controlar fácilmente observando el movimiento hacia abajo y hacia arriba del músculo de la espalda durante cada inhalación. Permita que el ratón se asiente en un área de sobremesa separada del área quirúrgica. Con un cortapelos de afeitar, afeite el pelo desde la cabeza del ratón hasta las primeras vértebras cervicales. Coloque el ratón en el escenario estereotáxico (consulte la Tabla de materiales) y asegure su posición con barras para los oídos y clip para la nariz. Mantener el flujo de isoflurano a la etapa estereotáxica al 1,5% de isoflurano y 0,5 L/min de caudal de oxígeno. Aplique el ungüento oftálmico lubricante en ambos ojos con un hisopo de algodón limpio para evitar la sequedad de los ojos durante la cirugía. Evalúe los reflejos del pedal en el ratón para confirmar que el ratón está completamente anestesiado antes de comenzar la cirugía. Desinfecte el área sin pelo con una solución de povidona yodada al 7,5% (ver Tabla de materiales) y etanol al 70% tres veces cada uno con hisopos de algodón estériles. Inyecte un pequeño volumen (50 μL) de lidocaína al 2% debajo de la piel del área sin pelo. Haga una incisión de 2 cm a través de la piel a lo largo de la línea media con un bisturí para exponer la lambda y el bregma del cráneo. Retire la fascia del cráneo con la ayuda de hisopos de algodón seco y fórceps puntiagudos. Después de que el bregma y la lambda sean visibles, use la punta de una rebaba de taladro dental (0,5 mm de diámetro) para medir las coordenadas Z de bregma y lambda (consulte la Tabla de materiales). Ajuste la altura del soporte de la nariz hasta que el bregma y la lambda se encuentren en la misma posición Z. Ubique la rebaba de taladro dental de 0,5 mm en una posición de A/P: 1,94 mm, M/L: 0,5 mm desde el bregma. Perfora el cráneo.NOTA: Aquí, para demostración, la región cerebral objetivo es el mPFC del ratón. Este protocolo se puede utilizar para apuntar a cualquier otra región profunda del cerebro. Por ejemplo, si el área cerebral objetivo es el Núcleo Accumbens (NAc), la posición correspondiente debe ser A/P: 0,9 mm, M/L: 1,2 mm. Retire la duramadre con una punta de aguja de 30 G y limpie todos los pedazos de restos óseos con pinzas afiladas en ángulo de 45 °.NOTA: El sangrado es común ya que los vasos sanguíneos pequeños pueden romperse durante la etapa de limpieza. Use hisopos de algodón estériles para detener el sangrado y aplique solución salina para lavar el área. Aplique solución salina en el área expuesta del cráneo para mantenerla húmeda. Cargue el virus en la jeringa de microlitro utilizando el panel de control de la microbomba. Retire 500 nL de burbuja de aire seguido de 800 nL del virus a un caudal de 50 nL/s.NOTA: Para fines de demostración, aquí, se inyecta un serotipo 1 de virus adenoasociado (AAV1) que expresa GCaMP6f (un GECI), AAV1-CamKII-GCamp6f, en el mPFC (consulte la Tabla de materiales). El título del virus es de 2,8 x 1013 GC/mL. Se diluye 1:2 en solución salina antes de la inyección. Coloque la punta de la aguja en la parte superior del bregma para tocar el bregma y anote la coordenada Z del bregma. Mueva la aguja por encima del orificio perforado e inyecte 100 nL del virus para asegurarse de que la aguja no esté obstruida. Desplácese lentamente por la aguja hacia el tejido cerebral hasta la coordenada Z objetivo de D / V: 1.75 mm y luego muévala ligeramente hasta la coordenada Z de D / V: 1.65 mm.NOTA: Esto es para crear un pequeño bolsillo para que la solución viral se infunda. Si la región cerebral objetivo es el NAc, la coordenada Z objetivo correspondiente de D / V debe ser de 4,2 mm, y luego moverse ligeramente hasta 4,1 mm. Utilice el panel de control para configurar la microbomba para inyectar 500 nL del virus a un caudal de 50 nL/min. Presione el botón EJECUTAR en el panel de control para inyectar el virus.NOTA: La inyección tardará unos 10 minutos. Después de que termine la inyección, espere 5-10 minutos adicionales antes de sacar la aguja del cerebro. Aplique con frecuencia solución salina para mantener húmeda el área expuesta del cráneo durante el período de inyección. Mueva la aguja hacia arriba y fuera del cerebro. Inyecte 500 nL de volumen dos veces al caudal de 50 nL/s.NOTA: Este paso confirma que se ha administrado un volumen adecuado del virus en el cerebro. Durante las primeras inyecciones de 500 nL, se libera el virus, seguido de burbujas de aire. Durante la segunda inyección de 500 nL, primero aparecen burbujas de aire, seguidas de solución salina. La jeringa ahora está lista para cargar el virus para el próximo ratón. Una vez que se realiza la cirugía, la jeringa y la aguja del microlitro se limpian a fondo con acetona seguida de solución salina. Alinee los bordes de la piel y cierre cuidadosamente la incisión con una sutura (tamaño 4.0). Aplique ungüento antibiótico en el área cosida para prevenir la infección. Retire el ratón de la etapa estereotáxica y devuélvalo a su jaula de origen. Coloque la jaula casera en una incubadora de 33 °C hasta que el ratón sea ambulatorio.NOTA: Por lo general, un ratón tarda de 10 a 15 minutos en despertarse de la anestesia con isoflurano antes de que comience a moverse. Después de que el ratón comience a moverse, administre medicamentos antiinflamatorios no esteroideos durante 3 días postquirúrgicos (ver Tabla de materiales). Deje que el ratón se recupere de la cirugía durante 14 días antes de buscar la implantación de la lente GRIN. 2. Implantación de lente GRIN en el mPFC (Figura 1) Preparación para la cirugía Preparar el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) que contiene 124 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 1,2 mM de MgCl2, 25 mM de glucosa, 26 mM de NaHCO3 y 2,4 mM de CaCl2. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos con un autoclave y colocarlos sobre una superficie estéril. Encienda la almohadilla térmica y mantenga la temperatura a 35 °C. Derretir el 1% de agarosa y mantenerla en un baño de agua a 42 °C hasta su uso.NOTA: La agarosa derretida se puede mantener en el baño de agua durante un par de horas. Desinfecte una lente GRIN (1 mm de diámetro, 4,38 mm de longitud, Figura 2A) en etanol al 70% durante 15 min, transfiérala a un tubo lleno de solución salina para enjuagarla adecuadamente antes de implantarla.NOTA: Las lentes GRIN (ver Tabla de Materiales) se producen a través del intercambio de iones de plata y litio en vidrios especiales, lo que las hace no tóxicas y amigables con las neuronas 6,7. Sin embargo, muchas lentes GRIN disponibles comercialmente pueden lixiviar residuos tóxicos, causando neurodegeneración, lo que las hace inadecuadas para la implantación en el cerebro vivo para estudios de imágenes in vivo a largo plazo. Estas lentes GRIN pueden requerir recubrimiento con agentes biocompatibles como el parileno-C para prevenir efectos secundarios tóxicos en las neuronas vecinas22. Pesar el ratón y anestesiarlo mediante una inyección intraperitoneal de la mezcla de ketamina/xilazina (ver Tabla de Materiales) (Ketamina: 100 mg/kg; Xilazina: 15 mg/kg).NOTA: Un ratón que pesa 30 g requiere 300 μL de mezcla de ketamina/xilazina (ketamina 100 mg/ml y xilazina 1,5 mg/ml) para la dosis inicial y 150 μL de ketamina (10 mg/ml) para dosis adicionales durante la cirugía. Para mantener al ratón anestesiado durante todo el proceso quirúrgico, se deben administrar dosis adicionales de ketamina (50 mg / kg) al menos una vez por hora. La etapa de anestesia del ratón debe ser monitoreada con frecuencia mediante la evaluación de los reflejos del pedal. Afeitar el cabello del área quirúrgica con una afeitadora y limpiar el cabello con una toalla de papel mojada. Coloque el ratón en la etapa estereotáxica y asegure su posición apretando el clip de la nariz y las barras de la oreja. Aplique ungüento oftálmico lubricante para los ojos en ambos ojos con un hisopo de algodón estéril. Confirme que el ratón está completamente anestesiado mediante la evaluación de los reflejos del pedal. Desinfecte el área sin pelo con una solución de povidona yodada al 7,5% y etanol al 70% tres veces cada uno con hisopos de algodón estériles. Administrar 2 mg/kg de dexametasona por vía intramuscular en el muslo para reducir el riesgo de hinchazón e inflamación relacionadas con la cirugía. Inyecte 50 μL de lidocaína al 2% debajo de la piel del área de cirugía. Use una tijera fina para extirpar un área triangular de la piel de 1,5 cm (altura) x 1,0 cm (base), desde el lado anterior entre los ojos hasta el lado posterior detrás de la lambda. Retire el tejido del periostio del cráneo con fórceps finos, micro-cuchillas e hisopos de algodón.NOTA: El cráneo debe limpiarse y secarse a fondo antes de seguir el siguiente paso. Aplique cianoacrilato (ver Tabla de materiales) en los bordes de la piel y adhiera la piel al cráneo. Espere 5 minutos hasta que el cianoacrilato se seque. Con la ayuda de una punta de rebaba de taladro de 0,5 mm, alinee el bregma y la lambda en el mismo plano horizontal ajustando la altura del clip de la nariz. Ubique una rebaba de taladro dental (1,2 mm de diámetro) en una posición de A/P: 1,94 mm, M/L: 0,8 mm desde el bregma. Perfora el cráneo. Retire la duramadre con una punta de aguja de 30 G y limpie todos los pedazos de restos óseos con pinzas afiladas en ángulo de 45 °.NOTA: Estos restos óseos pueden bloquear el paso de aspiración posterior si no se eliminan por completo. Conecte una aguja de extremo romo pulida manualmente de 27 G (Figura 2B) al soporte de la aguja acoplado a un brazo robótico inclinado con un ángulo de 10° (Figura 2C). Conecte el otro extremo del soporte de la aguja al sistema de vacío de la casa.NOTA: El brazo robótico (ver Tabla de Materiales) es desarrollado por el grupo del Dr. Lin en el NIDA/IRP y está controlado por un software de acceso abierto desarrollado a medida, AutoStereota (https://github.com/liang-bo/AutoStereota)23 Ubique la punta de la aguja con solo tocar el bregma. Establezca la coordenada Z de bregma en 0 haciendo clic en el botón Bregma en AutoStereota. Establezca el valor de la entrada X en 0.8, el valor de la entrada Y en 1.94, el valor de la entrada Z en 1.0, luego haga clic en el botón Buscar para mover la aguja a la parte superior del orificio perforado en el cráneo. Ajuste la posición de la aguja al centro del área de tejido cerebral expuesta a través de AutoStereota.NOTA: Para mover la aguja en direcciones laterales o mediales, introduzca el valor Paso y haga clic en los botones Lateral o Medial en AutoStereota. Del mismo modo, para mover la aguja en direcciones anterior o posterior y dorsal o ventral, haga clic en los botones Rostral o Caudal y Dorsal o Ventral , respectivamente. Encienda la aspiradora y comience a enjuagar el área expuesta del cerebro con ACSF a través de un sistema de tubos controlado por gravedad (consulte la Tabla de materiales) conectado a una aguja de 30 G con una punta doblada. ACSF se burbujea continuamente con una mezcla de gases de 95% O2 y 5% de CO2 y se filtra a través de un filtro de 0,2 μm.NOTA: El caudal acSF es de ~ 1,5 ml/min. La presión de salida de la mezcla de gas se mantiene en ~ 3 psi. Aspirar tejido cerebral capa por capa con la ayuda del software AutoStereota (Figura 3).NOTA: La aspiración del tejido cerebral se completa en 4 rondas para que se genere un bolsillo de columna (1,8 mm de profundidad y 1 mm de diámetro).En la sesión “zStep”, haga clic y verifique la primera y la segunda fila. Establezca los valores de la primera fila en 0,2 y 1. Establezca los valores de la segunda fila en 0,15 y 4 (Figura 3A). En la sesión “Modo”, establezca Needle size 27 Gauge y 1.2, establezca Dims 0.9. Todos los demás valores utilizan valores predeterminados (Figura 3A). Haga clic secuencialmente en los botones Establecer, Mantener cero e Inicio para iniciar la aspiración.NOTA: Esta es la1ª ronda de aspiración. Los valores de entrada indican que la profundidad de aspiración es de 0,2 mm (desde la coordenada Z de 0) durante el primer paso con 1 capa; durante el segundo paso, la profundidad de aspiración es de 0,15 mm, repetida continuamente durante 4 capas. La resolución de aspiración es de 1,2 y el diámetro es de 0,9 mm. Durante la aspiración, la ubicación instantánea de la punta de la aguja se puede monitorear a través del panel de gráfico de seguimiento. Tras completar esta ronda de aspiración, se genera un bolsillo de columna con 0,8 mm de profundidad y 1 mm de diámetro. La punta de la aguja volverá al centro con la coordenada Z de 0. En la sesión “zStep”, haga clic y verifique la primera y la segunda fila. Establezca los valores de la primera fila en 1 y 1. Establezca los valores de la segunda fila en 0,15 y 4 (Figura 3B). En la sesión “Modo”, mantenga todos los valores iguales que la ronda anterior (Figura 3B). Haga clic secuencialmente en los botones Establecer, Mantener cero e Inicio para iniciar la aspiración.NOTA: Esta es la2ª ronda de aspiración. Los valores de entrada indican que la profundidad de aspiración es de 1 mm (a partir de la coordenada Z de 0) durante el primer paso con 1 capa; durante el segundo paso, la profundidad de aspiración es de 0,15 mm, repetida continuamente durante 4 capas. Tras completar esta ronda de aspiración, se genera el bolsillo de la columna con 1,6 mm de profundidad y 1 mm de diámetro. En la sesión “zStep”, haga clic y marque solo la primera fila. Establezca los valores de la primera fila en 1.8 y 1 (Figura 3C). En la sesión “Modo”, configure Needle size 27 Gauge y 2.2. Todos los demás valores siguen siendo los mismos que los de la ronda anterior (Figura 3C). Haga clic secuencialmente en los botones Establecer, Mantener cero e Inicio para iniciar la aspiración.NOTA: Esta es la3ª ronda de aspiración. Los valores de entrada indican que la profundidad de aspiración es de 1,8 mm (desde la coordenada Z de 0) con 1 capa. La resolución de la aspiración es 2.2. Tras completar esta ronda de aspiración, se genera el bolsillo de la columna con 1,8 mm de profundidad y 1 mm de diámetro. En la sesión “zStep”, haga clic y marque solo la primera fila. Establezca los valores de la primera fila en 1,6 y 1 (Figura 3D). En la sesión “Modo”, establezca Needle size 27 Gauge y 2.2, establezca Dims 0.6 (Figura 3D). Haga clic secuencialmente en los botones Establecer, Mantener cero e Inicio , para iniciar la aspiración.NOTA: Esta es la4ª ronda de aspiración. El propósito de este paso es limpiar la sangre acumulada en el bolsillo. El sangrado es común a medida que los vasos sanguíneos pequeños se rompen durante el proceso de aspiración. Para limpiar a fondo la sangre, detenga la irrigación de ACSF durante 5 minutos y luego vuelva a encender la irrigación. Repita la4ª ronda de aspiración varias veces hasta que el bolsillo esté libre de sangre. Este protocolo se puede utilizar para apuntar a cualquier otra región profunda del cerebro. Por ejemplo, si el área cerebral objetivo es el NAc, la coordenada Z final correspondiente de D/V debe ser de 4,4 mm. Detener el vacío y el riego de ACSF. Lleve la aguja a +2 mm de coordenada Z y 0,5 mm antes del centro. Coloque la lente GRIN estéril de 1 mm en el bolsillo. Mantenga la punta de la aguja en contacto con la lente GRIN expuesta para asegurarse de que la lente GRIN se asiente en un ángulo de 10°. Presione suavemente la superficie superior de la lente GRIN con papel de seda blanda estéril para asegurarse de que la superficie inferior de la lente GRIN esté en contacto con el tejido cerebral. Aplique la agarosa derretida en el espacio entre la lente GRIN y el tejido cerebral con la ayuda de una espátula. Después de que la agarosa forme un gel, retire el exceso de agarosa con una micro-cuchilla. Limpie el cráneo a fondo con hisopos de solución salina y algodón. Deje que el cráneo se seque antes de la posterior aplicación de cemento dental (ver Tabla de Materiales). Saque bien la mezcla del congelador de -20 °C. Mezcle el polvo de cemento dental y el líquido catalizador y aplique una capa de cemento de resina adhesiva autocurable sobre el cráneo; primero, rodea la lente GRIN y luego cubre todo el cráneo expuesto. Espere 5 minutos y deje que se endurezca por completo. Retire la aguja de aspiración con cuidado. En un pozo de plástico limpio, mezcle polvo de cemento dental, carbón negro con líquido y aplique una capa delgada de la mezcla sobre la 1ª capa de cemento dental. Espere 5 minutos para dejar que se endurezca. Proteja la lente GRIN expuesta cubriéndola con una tapa personalizada hecha de un tubo de PCR (Figura 2D). Aplique cianoacrilato para unir la tapa al cemento dental. Inyecte 1 ml de solución salina precalentada por vía subcutánea en el ratón seguido de 0,1 mg/kg de buprenorfina. Coloque el ratón de nuevo en su jaula de origen. Coloque la jaula casera en una incubadora de 33 °C y controle al ratón hasta que sea ambulatorio. Por lo general, un ratón tarda de 20 a 40 minutos en despertarse de la anestesia antes de que comience a moverse. Administre medicamentos antiinflamatorios no esteroideos y controle al ratón durante al menos 3 días postquirúrgicos. Deje que el ratón se recupere de la cirugía durante 30 días. 3. Fijación del soporte del miniscopio (base) en el cráneo del ratón (Figura 1) Anestesiar al ratón en una cámara de inducción con 5% de isoflurano y 1 L/min de flujo de oxígeno hasta que su frecuencia respiratoria disminuya a 1 respiración/s. Coloque el ratón en el escenario estereotáxico y asegure su posición con barras para los oídos y clips para la nariz. Mantener un flujo continuo de isoflurano (1,5%) y oxígeno (0,5 L/min). Aplique ungüento oftálmico en sus ojos para mantenerlos húmedos. Encienda la almohadilla térmica y mantenga la temperatura a 35 °C. Confirme que el ratón está completamente anestesiado mediante la evaluación de los reflejos del pedal. Retire la tapa que cubre la lente GRIN suavemente con fórceps puntiagudas. Perfore los residuos secos de cianoacrilato del cemento dental completamente usando un microdrill (ver Tabla de Materiales). Corta el cabello alrededor del área de cemento dental con tijeras pequeñas. Limpie los escombros con la ayuda de un plumero de aire comprimido. Use un hisopo de algodón sumergido en acetona para limpiar la superficie superior de la lente GRIN. Prepare el miniscopio con su soporte (base). Coloque una tuerca hexagonal #00-90 (ver Tabla de Materiales) en la ranura presente en la base y aplique cianoacrilato para asegurarla allí (Figura 2E). Aplique una cinta de politetrafluoroetileno (PTFE) firmemente alrededor de la rosca del miniscopio y recorte la cinta adicional (Figura 2F). Sujete el miniscopio a la base y use el tornillo de bloqueo para asegurar el miniscopio a la base (Figura 2G). Conecte el miniscopio a su cable y encienda el software de acceso abierto desarrollado a medida, Actualmente de acceso abierto, NeuView (consulte la Tabla de materiales).NOTA: El software NeuView está desarrollado a medida para imágenes de calcio in vivo de miniscopio del grupo del Dr. Lin en el NIDA / IRP 7,12. Es de acceso abierto (https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0). En NeuView, haga clic en Hardware, marque LED1 y haga clic en el botón Transmitir para ver las imágenes en vivo (Figura 4A). Para detener la transmisión en vivo, haga clic en el botón Detener . Coloque el miniscopio en un brazo de sujeción de miniscopio personalizado (Figura 2H) cuya posición XYZ se puede manipular utilizando controladores motorizados (Figura 2I). Ubique el miniscopio justo encima de la lente GRIN expuesta y hágalo paralelo a la superficie de la lente. Baje lentamente el miniscopio hacia la lente GRIN y ajuste su posición Z hasta que se encuentre el mejor plano de enfoque.NOTA: El mejor plano focal se determina comparando varias posiciones Z posibles y seleccionando el plano focal con una visualización clara de la mayoría de los cuerpos celulares. Aplique la primera capa de cemento dental alrededor de la base del miniscopio con cuidado sin alterar la posición del miniscopio. Después de endurecer el cemento, retire suavemente el brazo de sujeción para que el miniscopio pueda pararse por sí solo en la cabeza del mouse.NOTA: El cemento dental tiende a encogerse después del endurecimiento, y arrastrará hacia abajo el miniscopio lejos del plano de enfoque original. Por lo general, la posición Z del miniscopio se eleva ligeramente por encima del plano focal original antes de aplicar cemento dental para compensar el cambio potencial. Aplique una segunda capa de cemento dental alrededor de la base para llenar todos los huecos y asegurarse de que no haya fugas de luz LED de los huecos. Deja que el cemento dental se endurezca. Retire el ratón de la etapa estereotáxica. Afloje el tornillo de bloqueo y desmonte el miniscopio de la base. Coloque una tapa protectora impresa en 3D en la base para proteger la lente GRIN expuesta y apriete el tornillo de bloqueo en la base (Figura 2J). Coloque el ratón de nuevo en su jaula de origen.NOTA: Por lo general, un ratón tarda de 10 a 15 minutos en despertarse de la anestesia con isoflurano antes de que comience a moverse. 4. Montaje del miniscopio e imágenes In vivo de Ca2+ (Figura 1) Monta el miniscopio en su base Anestesiar brevemente al ratón en la cámara de inducción (5% de isoflurano y 1 L/min de caudal de oxígeno). Coloque el ratón sobre una superficie de banco limpia. Afloje el tornillo de bloqueo con un destornillador pequeño, retire la tapa protectora y limpie la superficie de la lente GRIN con un hisopo de algodón empapado en acetona. Envuelva una cinta de PTFE firmemente alrededor de la rosca del miniscopio y fije el miniscopio a su base en la cabeza del mouse. Conecte el miniscopio al cable (Figura 2K), encienda el software NeuView. En NeuView, haga clic en Hardware, marque LED1 y haga clic en el botón Transmitir para ver las imágenes en vivo (Figura 4A). Identifique el mejor plano focal ajustando la posición del miniscopio en relación con la base, ya sea apretando ligeramente o aflojando con la ayuda de fórceps contundentes.NOTA: El mejor plano focal se determina comparando varias ubicaciones posibles y seleccionando la que tenga una visualización clara de la mayoría de los cuerpos celulares. Apriete el tornillo de bloqueo y vuelva a colocar el ratón en su jaula de casa. En NeuView, ajuste la potencia de la luz LED al nivel óptimo. Haga clic en Capturar y luego en los botones Activar para comenzar a grabar y presione Detener después de 150 cuadros.NOTA: La potencia más baja posible determina el nivel óptimo de potencia del LED para lograr una imagen lo suficientemente brillante. El propósito de grabar un video corto es facilitar la identificación del mismo plano focal en el futuro para imágenes repetitivas. Desconecte el cable del miniscopio. Deje que el ratón se recupere durante al menos 30 minutos antes de comenzar el experimento.NOTA: Para proteger el miniscopio, por lo general, la botella de agua y el alimentador de alimentos de alambre se retiran durante este corto período de tiempo. Si el ratón necesita permanecer en su jaula doméstica por más tiempo, se recomienda suministrar gel dietético disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) en la jaula doméstica. Adquisición de datos para imágenes de calcio in vivoNOTA: Las imágenes de calcio in vivo se pueden realizar simultáneamente junto con cualquier prueba de comportamiento que el investigador desee. Para el propósito de demostración, el ejemplo aquí es la imagen in vivo de Ca2+ durante una prueba de campo abierto. Para lograr este objetivo, se requieren dos computadoras. Una computadora está equipada con software comercial (consulte la Tabla de materiales) para controlar una cámara para registrar el comportamiento del mouse automáticamente. La otra computadora está equipada con NeuView para controlar el miniscopio y grabar las imágenes ca2+ . Encienda el software de la cámara de comportamiento (consulte la Tabla de materiales) para ver el campo de comportamiento del mouse a través de una función de transmisión en vivo. Ajuste manualmente el enfoque de la cámara superior (Figura 2L). Seleccione Trigger/Strobe y marque “Enable/disable trigger” (Figura 4B). Haga clic en el botón Grabar , use Examinar para seleccionar la ubicación donde se guardarán las grabaciones de comportamiento, seleccione el formato de imagen deseado.NOTA: La función “Trigger Control” está habilitada para permitir que el software NeuView active la grabación del comportamiento para que los fotogramas de comportamiento y los fotogramas de imagen de calcio correspondientes se acoplen temporalmente. La grabación del comportamiento se puede guardar en cualquier formato deseado. La grabación del comportamiento generalmente se guarda en formato JPEG en la carpeta designada. Acerque el ratón a la arena y conecte el miniscopio al cable conectado al sistema de adquisición de datos (Figura 2L) (consulte la Tabla de materiales). El ratón se coloca en el centro de la arena. Con la función Livestream del software NeuView, ajuste la potencia del LED para optimizar el brillo de la imagen de calcio.NOTA: Para las imágenes de calcio, la velocidad de fotogramas de grabación es de 10 fotogramas/s de forma predeterminada. En NeuView, desmarque LED1, haga clic en Capturar y luego en los botones Activar para comenzar a grabar, y presione Detener después de 100 cuadros.NOTA: Esto es para grabar imágenes de fondo para aproximadamente 100 cuadros con luz LED apagada. En el software de la cámara de comportamiento, haga clic en Iniciar grabación (Figura 4C). En NeuView, marque LED1, haga clic en Capturar y luego en los botones Activar para comenzar a grabar. Pulsa Detener después de 3000 fotogramas.NOTA: Esto es para registrar imágenes de calcio y comportamiento simultáneamente. La prueba de campo abierto dura 15 minutos, generalmente se divide en tres sesiones de grabación cada una de 5 minutos. Esto es para evitar que el miniscopio se sobrecaliente debido al uso continuo. Guarde las imágenes de calcio y las grabaciones de comportamiento en las carpetas designadas. Repita la grabación durante dos sesiones más mientras graba el fondo antes de cada sesión y guarde todas las grabaciones en la carpeta designada. Separe el miniscopio de su base. Una vez completada la grabación, desconecte el cable del miniscopio. Anestesiar brevemente al ratón en la cámara de inducción (5% de isoflurano y 1L/min de caudal de oxígeno). Coloque el ratón sobre una superficie limpia y cálida. Desenrosque el tornillo de bloqueo en la base y separe el miniscopio de la base. Vuelva a colocar la tapa protectora sobre la base y apriete el tornillo de bloqueo. Vuelva a colocar el ratón en su jaula de origen.