Injection virale stéréotaxique et implantation de lentilles à indice de gradient pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond

Le protocole expérimental suit les directives de soins aux animaux de l’Université du Wyoming. La souris utilisée dans cette étude est un mâle C57BL/6J âgé de 6 mois. La procédure peut être utilisée pour cibler toutes les régions profondes du cerveau pour l’imagerie calcique in vivo . Ici, pour démonstration, la zone cérébrale ciblée est la souris mPFC (antérieure et postérieure (A/P) : 1,94 mm, médiale et latérale (M/L) : 0,5 mm, dorsale et ventrale (D/V) : 1,8 mm). Ce protocole est modifié sur la base du protocole21 publié précédemment. 1. Injection stéréotaxique du virus dans le mPFC (Figure 1) Préparation à la chirurgie Stérilisez tous les instruments chirurgicaux à l’aide d’un autoclave et placez-les sur une surface stérile. Préparez une seringue de 10 μL en l’amorçant avec une solution saline et en la préremplissant avec 5 μL de solution saline. Fixez la seringue à une micropompe (voir tableau des matériaux). Allumez le coussin chauffant et maintenez la température à 35 °C. Placez la souris dans la chambre à induction (5 » x 10 » x 4 », longueur x largeur x hauteur) avec 5% d’isoflurane et 1 L/min de débit d’oxygène. Surveillez attentivement et comptez la fréquence respiratoire de la souris. Retirez la souris une fois que sa fréquence respiratoire diminue à 1 respiration / s.REMARQUE: La fréquence respiratoire de la souris peut être facilement surveillée en observant le mouvement musculaire vers le bas et vers le haut du dos lors de chaque inhalation. Laissez la souris s’installer sur une paillasse séparée de la zone chirurgicale. Avec une tondeuse à raser, rasez les poils de la tête de la souris jusqu’aux premières vertèbres cervicales. Installez la souris sur la scène stéréotaxique (voir Tableau des matériaux) et fixez sa position avec des barres d’oreille et un pince-nez. Maintenir le débit d’isoflurane au stade stéréotaxique à 1,5 % d’isoflurane et à 0,5 L/min de débit d’oxygène. Appliquez la pommade ophtalmique lubrifiante pour les yeux sur les deux yeux avec un coton-tige propre pour prévenir la sécheresse des yeux pendant la chirurgie. Évaluez les réflexes de pédale sur la souris pour confirmer que la souris est complètement anesthésiée avant de commencer la chirurgie. Désinfectez la zone sans poils avec une solution de povidone-iode à 7,5% (voir tableau des matériaux) et 70% d’éthanol trois fois chacun à l’aide de cotons-tiges stériles. Injecter un petit volume (50 μL) de lidocaïne à 2% sous la peau de la zone sans poils. Faites une incision de 2 cm à travers la peau le long de la ligne médiane à l’aide d’un scalpel pour exposer le lambda et le bregma du crâne. Retirez le fascia du crâne à l’aide de cotons-tiges secs et de pinces pointues. Une fois que le bregma et le lambda sont visibles, utilisez la pointe d’une bavure de forage dentaire (0,5 mm de diamètre) pour mesurer les coordonnées Z de bregma et lambda (voir Tableau des matériaux). Ajustez la hauteur du support de nez jusqu’à ce que le bregma et le lambda se trouvent à la même position Z. Placez la bavure de la perceuse dentaire de 0,5 mm dans une position de A/P : 1,94 mm, M/L : 0,5 mm du bregma. Percer le crâne.REMARQUE: Ici, pour démonstration, la région cérébrale ciblée est la souris mPFC. Ce protocole peut être utilisé pour cibler toute autre région profonde du cerveau. Par exemple, si la zone cérébrale ciblée est le Noyau Accumbens (NAc), la position correspondante doit être A/P : 0,9 mm, M/L : 1,2 mm. Retirez la dure-mère à l’aide d’une pointe d’aiguille de 30 G et nettoyez tous les débris osseux à l’aide d’une pince pointue inclinée à 45 °.REMARQUE: Les saignements sont fréquents car les petits vaisseaux sanguins peuvent se rompre pendant l’étape de nettoyage. Utilisez des cotons-tiges stériles pour arrêter le saignement et appliquez une solution saline pour laver la zone. Appliquez une solution saline sur la zone du crâne exposée pour la garder humide. Chargez le virus dans la seringue à microlitre à l’aide du panneau de commande de la micropompe. Retirer 500 nL de bulle d’air suivie de 800 nL du virus à un débit de 50 nL/s.REMARQUE: Aux fins de la démonstration, ici, un virus adéno-associé de sérotype 1 (AAV1) exprimant GCaMP6f (un GECI), AAV1-CamKII-GCamp6f, est injecté dans le mPFC (voir tableau des matériaux). Le titre du virus est de 2,8 x 1013 GC/mL. Il est dilué au 1:2 dans une solution saline avant l’injection. Placez la pointe de l’aiguille sur le dessus de la bregma pour toucher simplement la bregma et notez la coordonnée Z de bregma. Déplacez l’aiguille au-dessus du trou percé et injectez 100 nL du virus pour vous assurer que l’aiguille n’est pas bouchée. Descendez lentement l’aiguille dans le tissu cérébral jusqu’à la coordonnée Z ciblée de D/V: 1,75 mm, puis déplacez-la légèrement jusqu’à la coordonnée Z de D/V: 1,65 mm.REMARQUE: Il s’agit de créer une petite poche pour la solution virale à infuser. Si la région cérébrale ciblée est le NAc, la coordonnée Z ciblée correspondante de D/V doit être de 4,2 mm, puis légèrement monter jusqu’à 4,1 mm. Utilisez le panneau de commande pour régler la micropompe pour injecter 500 nL du virus au débit de 50 nL/min. Appuyez sur le bouton EXÉCUTER du panneau de configuration pour injecter le virus.REMARQUE: L’injection prendra environ 10 min. Une fois l’injection terminée, attendez 5 à 10 minutes supplémentaires avant de retirer l’aiguille du cerveau. Appliquez fréquemment une solution saline pour garder la zone du crâne exposée humide pendant la période d’injection. Déplacez l’aiguille vers le haut et hors du cerveau. Injecter deux fois un volume de 500 nL au débit de 50 nL/s.REMARQUE: Cette étape confirme qu’un volume approprié du virus a été administré dans le cerveau. Au cours des premières injections de 500 nL, le virus est libéré, suivi de bulles d’air. Lors de la deuxième injection de 500 nL, des bulles d’air apparaissent d’abord, suivies d’une solution saline. La seringue est maintenant prête à charger le virus pour la prochaine souris. Une fois la chirurgie terminée, la seringue et l’aiguille en microlitre sont soigneusement nettoyées avec de l’acétone suivie d’une solution saline. Alignez les bords de la peau et fermez soigneusement l’incision avec une suture (taille 4.0). Appliquez une pommade antibiotique sur la zone cousue pour prévenir l’infection. Retirez la souris de la scène stéréotaxique et retournez-la dans sa cage d’origine. Placez la cage de la maison dans un incubateur à 33 °C jusqu’à ce que la souris soit ambulatoire.REMARQUE: Il faut généralement 10-15 minutes pour qu’une souris se réveille de l’anesthésie à l’isoflurane avant de commencer à se déplacer. Une fois que la souris a commencé à se déplacer, administrer des anti-inflammatoires non stéroïdiens pendant 3 jours postopératoires (voir tableau des matériaux). Laissez la souris récupérer de la chirurgie pendant 14 jours avant de poursuivre l’implantation de la lentille GRIN. 2. Implantation de lentilles GRIN dans le mPFC (Figure 1) Préparation à la chirurgie Préparer le liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) contenant 124 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 1,2 mM de MgCl2, 25 mM de glucose, 26 mM de NaHCO3 et 2,4 mM de CaCl2. Stérilisez tous les instruments chirurgicaux à l’aide d’un autoclave et placez-les sur une surface stérile. Allumez le coussin chauffant et maintenez la température à 35 °C. Faire fondre 1% d’agarose et le conserver au bain-marie à 42 °C jusqu’à utilisation.REMARQUE: L’agarose fondue peut être conservée au bain-marie pendant quelques heures. Désinfecter une lentille GRIN (1 mm de diamètre, 4,38 mm de longueur, Figure 2A) dans de l’éthanol à 70 % pendant 15 min, la transférer dans un tube rempli de solution saline pour la rincer correctement avant l’implantation.REMARQUE: Les lentilles GRIN (voir Tableau des matériaux) sont produites par échange d’argent et de lithium-ion dans des lunettes spéciales, ce qui les rend non toxiques et respectueuses des neurones 6,7. Cependant, de nombreuses lentilles GRIN disponibles dans le commerce peuvent lessiver des résidus toxiques, provoquant une neurodégénérescence, ce qui les rend impropres à l’implantation dans le cerveau vivant pour des études d’imagerie in vivo à long terme. Ces lentilles GRIN peuvent nécessiter un revêtement avec des agents biocompatibles comme le parylène-C pour prévenir les effets secondaires toxiques sur les neurones voisins22. Peser la souris et l’anesthésier par injection intrapéritonéale de mélange kétamine/xylazine (voir tableau des matières) (kétamine:100 mg/kg; Xylazine : 15 mg/kg).REMARQUE: Une souris pesant 30 g nécessite 300 μL de mélange kétamine/xylazine (kétamine 100 mg/mL et xylazine 1,5 mg/mL) pour la dose initiale et 150 μL de kétamine (10 mg/mL) pour des doses supplémentaires pendant la chirurgie. Pour que la souris reste anesthésiée pendant tout le processus chirurgical, des doses supplémentaires de kétamine (50 mg / kg) doivent être administrées au moins une fois par heure. Le stade d’anesthésie de la souris doit être surveillé fréquemment en évaluant les réflexes de pédale. Rasez les cheveux de la zone chirurgicale avec un rasoir et nettoyez les cheveux à l’aide d’une serviette en papier humide. Placez la souris dans la scène stéréotaxique et sécurisez sa position en resserrant le pince-nez et les barres d’oreille. Appliquez une pommade ophtalmique lubrifiante pour les yeux sur les deux yeux avec un coton-tige stérile. Confirmez que la souris est entièrement anesthésiée en évaluant les réflexes de pédale. Désinfectez la zone sans poils avec une solution de povidone-iode à 7,5% et éthanol à 70% trois fois chacun à l’aide de cotons-tiges stériles. Administrer 2 mg /kg de dexaméthasone par voie intramusculaire dans la cuisse pour réduire le risque d’enflure et d’inflammation liées à la chirurgie. Injecter 50 μL de lidocaïne à 2 % sous la peau de la zone chirurgicale. Utilisez un ciseau fin pour exciser une zone de peau triangulaire de 1,5 cm (hauteur) x 1,0 cm (base), de la face antérieure entre les yeux jusqu’à la face postérieure derrière le lambda. Retirez le tissu du périoste du crâne à l’aide de pinces fines, de micro-lames et de cotons-tiges.REMARQUE: Le crâne doit être soigneusement nettoyé et séché avant de poursuivre l’étape suivante. Appliquer le cyanoacrylate (voir tableau des matériaux) sur les bords de la peau et attacher la peau au crâne. Attendez 5 min jusqu’à ce que le cyanoacrylate sèche. À l’aide d’une pointe de bavure de forage de 0,5 mm, alignez le bregma et le lambda dans le même plan horizontal en ajustant la hauteur du clip de nez. Placez une bavure de perceuse dentaire (1,2 mm de diamètre) à une position de A/P: 1,94 mm, M/L: 0,8 mm de la bregma. Percer le crâne. Retirez la dure-mère à l’aide d’une pointe d’aiguille de 30 G et nettoyez tous les débris osseux à l’aide d’une pince pointue inclinée à 45 °.REMARQUE: Ces débris osseux peuvent bloquer l’étape d’aspiration suivante s’ils ne sont pas complètement enlevés. Fixez une aiguille à extrémité émoussée polie manuellement de 27 G (Figure 2B) au porte-aiguille couplé à un bras robotique incliné avec un angle de 10° (Figure 2C). Connectez l’autre extrémité du porte-aiguille au système d’aspiration de la maison.REMARQUE: Le bras robotique (voir table des matériaux) est développé par le groupe du Dr Lin au NIDA / IRP et est contrôlé par un logiciel développé sur mesure, actuellement en libre accès, AutoStereota (https://github.com/liang-bo/AutoStereota)23 Localisez le bout de l’aiguille pour simplement toucher le bregma. Définissez la coordonnée Z de bregma sur 0 en cliquant sur le bouton Bregma sur AutoStereota. Définissez la valeur d’entrée X sur 0,8, la valeur d’entrée Y sur 1,94, la valeur d’entrée Z sur 1,0, puis cliquez sur le bouton Rechercher pour déplacer l’aiguille sur le dessus du trou percé sur le crâne. Ajustez la position de l’aiguille au centre de la zone du tissu cérébral exposée via AutoStereota.REMARQUE: Pour déplacer l’aiguille dans des directions latérales ou médiales, entrez la valeur Étape et cliquez sur les boutons Latéral ou Médial sur AutoStereota. De même, pour déplacer l’aiguille dans les directions antérieure ou postérieure et dorsale ou ventrale, cliquez sur les boutons rostral ou caudal et dorsal ou ventral , respectivement. Allumez le vide et commencez à rincer la zone cérébrale exposée avec ACSF à l’aide d’un système de tuyauterie à gravité contrôlée (voir Tableau des matériaux) relié à une aiguille de 30 G avec une pointe pliée. L’ACSF est continuellement bouillonné avec un mélange de gaz de 95% O2 et 5% de CO2 et filtré à travers un filtre de 0,2 μm.REMARQUE: Le débit ACSF est d’environ 1,5 mL / min. La pression de sortie du mélange de gaz est maintenue à ~3 psi. Aspirer le tissu cérébral couche par couche à l’aide du logiciel AutoStereota (Graphique 3).REMARQUE: L’aspiration du tissu cérébral est complétée en 4 tours afin qu’une poche de colonne (1,8 mm de profondeur et 1 mm de diamètre) soit générée.Dans la session « zStep », cliquez et vérifiez les première et deuxième lignes. Définissez les valeurs de la première ligne sur 0,2 et 1. Définissez les valeurs de la deuxième ligne sur 0,15 et 4 (Figure 3A). Dans la session « Mode », réglez la taille de l’aiguille 27 Gauge et 1.2, réglez Dims 0.9. Toutes les autres valeurs utilisent des valeurs par défaut (Figure 3A). Cliquez séquentiellement sur les boutons Définir, Conserver zéro et Démarrer pour lancer l’aspiration.REMARQUE: C’est le1er tour d’aspiration. Les valeurs d’entrée indiquent que la profondeur d’aspiration est de 0,2 mm (à partir de la coordonnée Z de 0) au cours de la première étape avec 1 couche; lors de la deuxième étape, la profondeur d’aspiration est de 0,15 mm, répétée en continu pendant 4 couches. La résolution d’aspiration est de 1,2 et le diamètre est de 0,9 mm. Pendant l’aspiration, l’emplacement instantané de la pointe de l’aiguille peut être surveillé via le panneau graphique de piste. Après avoir terminé ce tour d’aspiration, une poche de colonne de 0,8 mm de profondeur et de 1 mm de diamètre est générée. La pointe de l’aiguille sera de retour au centre avec la coordonnée Z de 0. Dans la session « zStep », cliquez et vérifiez les première et deuxième lignes. Définissez les valeurs de la première ligne sur 1 et 1. Définissez les valeurs de la deuxième ligne sur 0,15 et 4 (Figure 3B). Dans la session « Mode », conservez toutes les valeurs identiques à celles du tour précédent (Figure 3B). Cliquez séquentiellement sur les boutons Définir, Conserver zéro et Démarrer pour lancer l’aspiration.NOTE: Il s’agit du 2ème tour d’aspiration. Les valeurs d’entrée indiquent que la profondeur d’aspiration est de 1 mm (à partir de la coordonnée Z de 0) au cours de la première étape avec 1 couche; lors de la deuxième étape, la profondeur d’aspiration est de 0,15 mm, répétée en continu pendant 4 couches. Après avoir terminé ce tour d’aspiration, la poche de colonne de 1,6 mm de profondeur et de 1 mm de diamètre est générée. Dans la session « zStep », cliquez et vérifiez uniquement la première ligne. Définissez les valeurs de la première ligne sur 1,8 et 1 (Figure 3C). Dans la session « Mode », réglez la taille de l’aiguille 27 Gauge et 2.2. Toutes les autres valeurs restent les mêmes que celles du tour précédent (Figure 3C). Cliquez séquentiellement sur les boutons Définir, Conserver zéro et Démarrer pour lancer l’aspiration.REMARQUE: Il s’agit du3ème cycle d’aspiration. Les valeurs d’entrée indiquent que la profondeur d’aspiration est de 1,8 mm (à partir de la coordonnée Z de 0) avec 1 couche. La résolution d’aspiration est de 2,2. Après avoir terminé ce tour d’aspiration, la poche de colonne de 1,8 mm de profondeur et de 1 mm de diamètre est générée. Dans la session « zStep », cliquez et vérifiez uniquement la première ligne. Définissez les valeurs de la première ligne sur 1,6 et 1 (Figure 3D). Dans la session « Mode », réglez taille de l’aiguille 27 Jauge et 2.2, réglez Dims 0.6 (Figure 3D). Cliquez séquentiellement sur les boutons Définir, Conserver zéro et Démarrer pour lancer l’aspiration.NOTE: Il s’agit du 4ème cycle d’aspiration. Le but de cette étape est de nettoyer le sang accumulé dans la poche. Les saignements sont fréquents car les petits vaisseaux sanguins se rompent pendant le processus d’aspiration. Pour bien nettoyer le sang, arrêtez l’irrigation de l’ACSF pendant 5 minutes, puis remettez l’irrigation en marche. Répétez le 4ème cycle d’aspiration plusieurs fois jusqu’à ce que la poche soit sans sang. Ce protocole peut être utilisé pour cibler toute autre région profonde du cerveau. Par exemple, si la zone cérébrale ciblée est le NAc, la coordonnée Z finale correspondante de D/V doit être de 4,4 mm. Arrêtez le vide et l’irrigation de l’ACSF. Amenez l’aiguille à +2 mm de coordonnée Z et 0,5 mm avant au centre. Placez l’objectif GRIN stérile de 1 mm dans la poche. Gardez l’extrémité de l’aiguille en contact avec la lentille GRIN exposée pour vous assurer que la lentille GRIN est fixée à un angle de 10 °. Appuyez doucement sur la surface supérieure de la lentille GRIN avec du papier de soie souple stérile pour vous assurer que la surface inférieure de la lentille GRIN est en contact avec le tissu cérébral. Appliquez l’agarose fondue dans l’espace entre la lentille GRIN et le tissu cérébral à l’aide d’une spatule. Après que l’agarose a formé un gel, éliminer l’excès d’agarose à l’aide d’une micro-lame. Nettoyez soigneusement le crâne avec une solution saline et des cotons-tiges. Laissez sécher le crâne avant l’application ultérieure de ciment dentaire (voir tableau des matériaux). Sortez bien le mélange du congélateur à -20 °C. Mélanger la poudre de ciment dentaire et le liquide catalyseur et appliquer une couche de ciment de résine adhésive auto-durcissante sur le crâne; Tout d’abord, entourez la lentille GRIN, puis couvrez tout le crâne exposé. Attendez 5 min et laissez-le durcir complètement. Retirez soigneusement l’aiguille d’aspiration. Dans un puits en plastique propre, mélangez de la poudre de ciment dentaire, du charbon noir avec du liquide et appliquez une fine couche du mélange sur la 1ère couche de ciment dentaire. Attendez 5 min pour le laisser durcir. Protégez la lentille GRIN exposée en la recouvrant d’un capuchon personnalisé fabriqué à partir d’un tube PCR (Figure 2D). Appliquez du cyanoacrylate pour fixer le bouchon au ciment dentaire. Injecter 1 mL de solution saline préaverdie par voie sous-cutanée chez la souris, suivi de 0,1 mg/kg de buprénorphine. Replacez la souris dans sa cage d’accueil. Placez la cage de la maison dans un incubateur à 33 °C et surveillez la souris jusqu’à ce qu’elle soit ambulatoire. Il faut généralement 20 à 40 minutes pour qu’une souris se réveille de l’anesthésie avant de commencer à se déplacer. Administrer des anti-inflammatoires non stéroïdiens et surveiller la souris pendant au moins 3 jours postopératoires. Laissez la souris récupérer de la chirurgie pendant 30 jours. 3. Fixation du support de miniscope (base) sur le crâne de la souris (Figure 1) Anesthésier la souris dans une chambre d’induction avec 5% d’isoflurane et un débit d’oxygène de 1 L/min jusqu’à ce que sa fréquence respiratoire diminue à 1 respiration/s. Placez la souris dans la scène stéréotaxique et sécurisez sa position avec des barres d’oreille et des pinces nasales. Maintenir un flux continu d’isoflurane (1,5 %) et d’oxygène (0,5 L/min). Appliquez une pommade ophtalmique sur ses yeux pour les garder humides. Allumez le coussin chauffant et maintenez la température à 35 °C. Confirmez que la souris est entièrement anesthésiée en évaluant les réflexes de pédale. Retirez doucement le capuchon qui recouvre la lentille GRIN à l’aide d’une pince pointue. Percer complètement les résidus de cyanoacrylate séchés du ciment dentaire à l’aide d’une microperceuse (voir tableau des matériaux). Coupez les cheveux autour de la zone de ciment dentaire avec de petits ciseaux. Nettoyez les débris à l’aide d’un dépoussiéreur à air comprimé. Utilisez un coton-tige trempé à l’acétone pour nettoyer la surface supérieure de la lentille GRIN. Préparez le miniscope avec son support (base). Placez un écrou hexagonal #00-90 (voir Tableau des matériaux) dans la fente présente dans la base et appliquez du cyanoacrylate pour y fixer (Figure 2E). Appliquez un ruban de polytétrafluoroéthylène (PTFE) hermétiquement autour du filetage du miniscope et coupez le ruban supplémentaire (Figure 2F). Fixez le miniscope à la base et utilisez la vis de verrouillage pour fixer le miniscope à la base (Figure 2G). Connectez le miniscope à son câble et allumez le logiciel développé sur mesure, actuellement en libre accès, NeuView (voir Tableau des matériaux).REMARQUE: Le logiciel NeuView est développé sur mesure pour l’imagerie calcique in vivo miniscope du groupe du Dr Lin au NIDA / IRP 7,12. Il est en libre accès (https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0). Dans NeuView, cliquez sur Matériel, cochez LED1, puis cliquez sur le bouton Flux pour afficher les images en direct (Figure 4A). Pour arrêter la diffusion en direct, cliquez sur le bouton Arrêter . Installez le miniscope dans un bras de maintien de miniscope personnalisé (Figure 2H) dont la position XYZ peut être manipulée à l’aide de contrôleurs motorisés (Figure 2I). Localisez le miniscope juste au-dessus de l’objectif GRIN exposé et rendez-le parallèle à la surface de l’objectif. Abaissez lentement le miniscope vers l’objectif GRIN et ajustez sa position Z jusqu’à ce que le meilleur plan de mise au point soit trouvé.REMARQUE: Le meilleur plan focal est déterminé en comparant plusieurs positions Z possibles et en sélectionnant le plan focal avec une visualisation claire de la plupart des corps cellulaires. Appliquez soigneusement la première couche de ciment dentaire autour de la base du miniscope sans modifier la position du miniscope. Une fois le ciment durci, retirez doucement le bras de maintien de sorte que le miniscope puisse se tenir seul sur la tête de la souris.REMARQUE: Le ciment dentaire a tendance à rétrécir après durcissement, et il fera glisser le miniscope loin du plan de mise au point d’origine. En règle générale, la position Z du miniscope est légèrement soulevée au-dessus du plan focal d’origine avant d’appliquer du ciment dentaire pour compenser le changement potentiel. Appliquez une deuxième couche de ciment dentaire autour de la base pour combler tous les espaces et vous assurer qu’il n’y a pas de fuite de lumière LED des espaces. Laissez le ciment dentaire durcir. Retirez la souris de l’étage stéréotaxique. Desserrez la vis de verrouillage et détachez le miniscope de la base. Placez un capuchon de protection imprimé en 3D dans la base pour protéger la lentille GRIN exposée et serrez la vis de verrouillage dans la base (Figure 2J). Replacez la souris dans sa cage d’accueil.REMARQUE: Il faut généralement 10-15 minutes pour qu’une souris se réveille de l’anesthésie à l’isoflurane avant de commencer à se déplacer. 4. Montage du miniscope et imagerie in vivo Ca2+ (Figure 1) Montez le miniscope à sa base Anesthésier brièvement la souris dans la chambre d’induction (5% d’isoflurane et 1 L/min de débit d’oxygène). Placez la souris sur une surface de banc propre. Desserrez la vis de verrouillage avec un petit tournevis, retirez le capuchon de protection et nettoyez la surface de la lentille GRIN avec un coton-tige imbibé d’acétone. Enroulez fermement un ruban en PTFE autour du filetage du miniscope et fixez le miniscope à sa base sur la tête de la souris. Connectez le miniscope au câble (Figure 2K), allumez le logiciel NeuView. Dans NeuView, cliquez sur Matériel, cochez LED1, puis cliquez sur le bouton Flux pour afficher les images en direct (Figure 4A). Identifiez le meilleur plan focal en ajustant la position du miniscope par rapport à la base, en resserrant légèrement ou en desserrant légèrement à l’aide de pinces contondantes.REMARQUE: Le meilleur plan focal est déterminé en comparant plusieurs emplacements possibles et en sélectionnant celui avec une visualisation claire de la plupart des corps cellulaires. Serrez la vis de verrouillage et replacez la souris dans sa cage d’accueil. Dans NeuView, réglez la puissance lumineuse led au niveau optimal. Cliquez sur Capturer , puis sur les boutons Déclencher pour démarrer l’enregistrement et appuyez sur Arrêter après 150 images.REMARQUE: La puissance la plus faible possible détermine le niveau optimal de la puissance de la LED pour obtenir une image suffisamment lumineuse. Le but de l’enregistrement d’une courte vidéo est de faciliter l’identification du même plan focal à l’avenir pour l’imagerie répétitive. Déconnectez le câble du miniscope. Laissez la souris récupérer pendant au moins 30 minutes avant de commencer l’expérience.REMARQUE: Pour protéger le miniscope, généralement, la bouteille d’eau et le chargeur alimentaire en fil sont retirés pendant cette courte période de temps. Si la souris doit rester plus longtemps dans sa cage d’origine, il est recommandé de fournir du gel diététique disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux) dans la cage de la maison. Acquisition de données pour l’imagerie calcique in vivoREMARQUE: L’imagerie calcique in vivo peut être effectuée simultanément avec tous les tests de comportement souhaités par le chercheur. À des fins de démonstration, l’exemple ici est l’imagerie in vivo Ca2+ lors d’un test en champ ouvert. Pour atteindre cet objectif, deux ordinateurs sont nécessaires. Un ordinateur est équipé d’un logiciel commercial (voir Tableau des matériaux) pour contrôler une caméra afin d’enregistrer automatiquement le comportement de la souris. L’autre ordinateur est équipé de NeuView pour contrôler le miniscope et enregistrer les images Ca2 +. Activez le logiciel de la caméra de comportement (voir Tableau des matériaux) pour afficher l’arène de comportement de la souris via une fonction Livestream. Réglez manuellement la mise au point de l’appareil photo supérieur (Figure 2L). Sélectionnez Trigger/Strobe et cochez « Activer/désactiver le déclencheur » (Figure 4B). Cliquez sur le bouton Enregistrer , utilisez Parcourir pour sélectionner l’emplacement où les enregistrements de comportement seront enregistrés, sélectionnez le format d’image souhaité.REMARQUE: La fonction « Trigger Control » est activée pour permettre à l’enregistrement du comportement d’être déclenché par le logiciel NeuView afin que les trames de comportement et les images d’imagerie calcique correspondantes soient couplées temporellement ensemble. L’enregistrement du comportement peut être enregistré dans n’importe quel format souhaité. L’enregistrement de comportement est généralement enregistré au format JPEG dans le dossier désigné. Rapprochez la souris de l’arène et connectez le miniscope au câble relié au système d’acquisition de données (Figure 2L) (voir tableau des matériaux). La souris est ensuite placée au centre de l’arène. Avec la fonction Livestream du logiciel NeuView, réglez la puissance des LED pour optimiser la luminosité de l’image calcique.REMARQUE: Pour l’imagerie calcique, la fréquence d’images d’enregistrement est de 10 images / s par défaut. Dans NeuView, décochez LED1, cliquez sur Capturer , puis sur Les boutons Déclencheur pour démarrer l’enregistrement, puis appuyez sur Arrêter après 100 images.REMARQUE: Il s’agit d’enregistrer des images d’arrière-plan pour environ 100 images avec la lumière LED éteinte. Dans le logiciel de la caméra de comportement, cliquez sur Démarrer l’enregistrement (Figure 4C). Dans NeuView, cochez LED1, cliquez sur Capturer, puis sur les boutons De déclenchement pour démarrer l’enregistrement. Appuyez sur Arrêter après 3000 images.REMARQUE: Il s’agit d’enregistrer simultanément l’imagerie et le comportement du calcium. Le test en champ ouvert dure 15 minutes, généralement décomposé en trois sessions d’enregistrement de 5 minutes chacune. Il s’agit d’éviter que le miniscope ne surchauffe en raison d’une utilisation continue. Enregistrez à la fois l’imagerie calcique et les enregistrements de comportement dans les dossiers désignés. Répétez l’enregistrement pendant deux sessions supplémentaires tout en enregistrant l’arrière-plan avant chaque session et enregistrez tous les enregistrements dans le dossier désigné. Détachez le miniscope de sa base. Une fois l’enregistrement terminé, déconnectez le câble du miniscope. Anesthésier brièvement la souris dans la chambre d’induction (5% d’isoflurane et 1L/min de débit d’oxygène). Placez la souris sur une surface propre et chaude. Dévissez la vis de verrouillage dans la base et détachez le miniscope de la base. Remettez le capuchon de protection sur la base et serrez la vis de verrouillage. Remettez la souris dans sa cage d’origine.