Sivrisinek Aedes aegypti'de Yüksek Çözünürlüklü Eriyik Analizi Kullanarak CRISPR/Cas9 Mutagenesis'i Takip Eden Indel Tespiti
Summary
Bu makalede, CRISPR/Cas9 tarafından indüklenen indellerin hızlı tanımlanması ve sivrisinek Aedes aegypti’deki mutant çizgilerinin yüksek çözünürlüklü eriyik analizi kullanılarak seçilmesi için bir protokol ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Abstract
Transkripsiyon-aktivatör benzeri efektör nükleazları (TALENler), çinko parmak nükleazları (ZFN’ler) ve homing endonucleases (HEs) gibi sistemlerin kurulmasıyla sivrisinek gen düzenlemesi çeşitli laboratuvarlarda rutin hale gelmiştir. Daha yakın zamanda, kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)/CRISPR ile ilişkili protein 9 (Cas9) teknolojisi hassas genom mühendisliği için daha kolay ve ucuz bir alternatif sunmuştır. Nükleaz eylemini takiben, DNA onarım yolları kırık DNA uçlarını düzeltecek ve genellikle indelleri tanıtacaktır. Bu çerçeve dışı mutasyonlar daha sonra hedef organizmalardaki gen fonksiyonunu anlamak için kullanılır. Bununla birlikte, bir dezavantajı, mutant bireylerin baskın bir işaret taşıması, mutant alellerinin tanımlanması ve izlenmesini, özellikle birçok deney için gerekli ölçeklerde zor hale getirmeleridir.
Yüksek çözünürlüklü eriyik analizi (HRMA), nükleik asit dizilerindeki varyasyonları tanımlamak için basit bir yöntemdir ve bu varyasyonları tespit etmek için PCR erime eğrilerini kullanır. Bu PCR sonrası analiz yöntemi, sıcaklık rampası kontrol veri yakalama özelliğine sahip ve kolayca 96 kuyu plaka formatlarına ölçeklendirilen enstrümantasyonlu floresan çift iplikli DNA bağlayıcı boyalar kullanır. Burada, CRISPR/ Cas9 kaynaklı indellerin hızlı tespiti ve sivrisinek Ae. aegypti’de mutant hatlarının kurulması için HRMA kullanan basit bir iş akışı açıklanmıştır. Kritik olarak, tüm adımlar az miktarda bacak dokusu ile yapılabilir ve organizmadan ödün vermeyi gerektirmez, genotiplemeden sonra genetik haçların veya fenotipleme testlerinin yapılmasına izin verir.
Introduction
Dang1, Zika2 ve chikungunya3 virüsleri gibi patojenlerin vektörleri ve sıtma parazitleri4 olarak, sivrisinekler insanlar için önemli bir halk sağlığı tehdidini temsil eder. Tüm bu hastalıklar için, sivrisinek vektörlerinin kontrolüne önemli bir bulaşma müdahalesi odağı vardır. Örneğin, patojenlere izin verme, sivrisinek zindeliği, hayatta kalma, üreme ve insektisitlere karşı dirençte önemli genlerin incelenmesi, yeni sivrisinek kontrol stratejileri geliştirmek için anahtardır. Bu amaçlar için, sivrisineklerde genom düzenleme, özellikle HE’ler, ZFN’ler, TALEN’ler ve en son CAS9 ile CRISPR gibi teknolojilerin geliştirilmesiyle yaygın bir uygulama haline gelmektedir. Gen düzenlemeli suşların kurulması tipik olarak hedef dışı ve kurucu (darboğaz) etkileri en aza indirmek için birkaç nesil boyunca istenen mutasyonları taşıyan bireylerin geriye doğru geriye doğru dönmesini ve ardından homoziöz veya trans-heterozipöz çizgiler oluşturmak için heterozipöz bireyleri geçmeyi içerir. Baskın bir belirtecin yokluğunda, moleküler genotipleme bu süreçte gereklidir, çünkü çoğu durumda heterozipöz mutantlar için net fenotipik özellikler tespit edilemez.
Sıralama genotipik karakterizasyon için altın standart olmasına rağmen, bunu yüzlerce veya muhtemelen binlerce bireyde gerçekleştirmek, özellikle sivrisinekler gibi kısa ömürlü organizmalar için kritik olan sonuç elde etmek için gereken önemli maliyetler, emek ve zaman oluşturur. Surveyor nükleaz tahlil5 (SNA), T7E1 tahlil6 ve yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA, in7) yaygın olarak kullanılan alternatiflerdir. Hem SNA hem de T7E1, yalnızca eşleşmeyen tabanları ayıran endonucleases kullanır. Heterozygous mutant genomunun mutasyona uğramış bir bölgesi yükseltildiğinde, mutant ve vahşi tip alellerden dna parçaları, eşleşmeyen çift iplikli DNA (dsDNA) yapmak için tavlanır. SNA, uyumsuzlığa özgü bir endonokleaz ve basit agarose jel elektroforezi ile sindirim yoluyla uyuşmazlıkların varlığını tespit eder. Alternatif olarak, HRMA, dsDNA bağlayıcı floresan boyalar tarafından tespit edilen dsDNA’nın termodinamik özelliklerini kullanır ve boyanın ilişkiden çıkarma sıcaklığı mutasyonun varlığına ve türüne bağlı olarak değişir. HRMA, tek nükleotid polimorfizmlerinin (SNP’ler)8, zebra balıklarının mutant genotiplemesinin, mikrobiyolojik uygulamaların10 ve bitki genetik araştırmalarının tespiti için kullanılmıştır11.
Bu makalede, CRISPR/Cas9 teknolojisi tarafından üretilen mutant sivrisinekler için basit bir moleküler genotipleme yöntemi olan HRMA açıklanmaktadır. HRMA’nın alternatif tekniklere göre avantajları arasında 1) esneklik, çeşitli genler, çok çeşitli indel boyutlarının yanı sıra farklı indel boyutları ile heterozipöz, homozigot ve trans-heterozygöz farklılaşma arasındaki ayrım için yararlı olduğu kanıtlanmıştır12,13,14, 2) maliyet, yaygın olarak kullanılan PCR reaktiflerine dayandığı için ve 3) zaman kazandıran, sadece birkaç saat içinde gerçekleştirilebileceği için. Ek olarak, protokol DNA kaynağı olarak küçük bir vücut parçası (bacak) kullanır, sivrisineklerin genotipleme işleminden kurtulmasını sağlar, mutant hatlarının kurulmasına ve bakımına izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yüksek çözünürlüklü eriyik analizi, CRISPR/Cas9 teknolojisi tarafından üretilen indellerin vektör sivrisinek Ae. aegypti’de tanımlanması için basit ve hızlı bir çözüm sunar. Uçuş kasından demir metabolizmasına ve daha fazla 13,14’e kadar çok çeşitli genler için mutasyona uğramış sivrisineklerin genotiplemesini sağlayan esneklik sağlar. HRMA, numune toplamadan son analizlere kadar sadece birkaç saat içinde gerçekleştiril…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tüm rakamlar Texas A&M Üniversitesi lisansı altında Biorender.com ile oluşturuldu. Bu çalışma, Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalık Enstitüsü (AI137112 ve AI115138’den Z.N.A.’ya), Böcek Vektörlü Hastalık Hibe Programı kapsamında Texas A&M AgriLife Research ve USDA Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü, Hatch proje 1018401 tarafından desteklendi.
Materials
| 70% Ethanol | 70% ethanol solution in water | ||
| 96-well PCR and Real-time PCR plates | VWR | 82006-636 | For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg) |
| 96-well plate templates | House-made printed, for genotype recording | ||
| Bio Rad CFX96 | Bio Rad | PCR machine with gradient and HRMA capabilities | |
| Diversified Biotech reagent reservoirs | VWR | 490006-896 | |
| Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit | New England Biolabs | E1050S | |
| Glass Petri Dish | VWR | 89001-246 | 150 mm x 20 mm |
| Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates | Bio-rad | HSP9665 | For HRMA |
| Multi-channel pipettor (P10) | Integra Biosciences | 4721 | |
| Multi-channel pipettor (P300) | Integra Biosciences | 4723 | |
| Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific | VWR | 37000-548 | To use with the 96-well PCR plates for obtaining genomic DNA |
| Optical sealing tape | Bio-rad | 2239444 | To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA |
| Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) | Thermo Fisher | F140WH | For obtaining genomic DNA and performing PCR |
| Plastic Fly Vial Dividers | Genesee | 59-128W | |
| Precision Melt Analysis Software | Bio Rad | 1845025 | Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3) |
| SeqMan Pro | DNAstar Lasergene software | For multiple sequence alignment | |
| Single-channel pipettor | Gilson | ||
| Tweezers Dumont #5 11 cm | WPI | 14098 | |
| White foam plugs | VWR | 60882-189 | |
| Wide Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee | 32-117 | |
| Wide Fly Vial Tray, Blue | Genesee | 59-164B |
References
- WHO. Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. WHO. , 160 (2009).
- WHO. Zika epidemiology update. WHO. , 1-13 (2019).
- WHO. Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever. WHO. , (2009).
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791 (2020)
- Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
- Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection. Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).
- Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Tong, S. Y., Giffard, P. M. Microbiological applications of high-resolution melting analysis. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).
- Simko, I. High-resolution DNA melting analysis in plant research. Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).
- Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).
- O’Leary, S., Adelman, Z. N. CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971 (2020).
- Kojin, B. B., et al. Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands. Malaria Journal. 20 (1), 11 (2021).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Larkin, M. A., et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).
- Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316 (2017).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).
