モスキートAedes aegyptiにおける高解像度メルト分析を用いたCRISPR/Cas9突然変異誘発に続くインデル検出
Summary
この記事では、CRISPR/Cas9によって誘導されるインデルの迅速な同定と、高解像度の溶融分析を用いた蚊 Aedes aegypti の突然変異線の選択のためのプロトコルについて詳しく説明します。
Abstract
蚊の遺伝子編集は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALENs)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZCN)、ホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)などのシステムを確立したいくつかの研究室で日常的になっています。最近では、クラスター化された定期的に間隔を合わせた短いパリンドローム反復(CRISPR)/CRISPR関連タンパク質9(Cas9)技術は、精密ゲノム工学のためのより簡単で安価な代替手段を提供しています。ヌクレアーゼ作用に続いて、DNA修復経路は壊れたDNA末端を固定し、しばしばインデルを導入する。これらのフレーム外突然変異は、標的生物の遺伝子機能を理解するために使用される。しかし、欠点は、突然変異体が支配的なマーカーを持たないことであり、特に多くの実験に必要なスケールでは、突然変異対立胞の同定と追跡が困難である。
高分解能溶融解析(HRMA)は、核酸配列の変動を同定する簡単な方法であり、PCR融解曲線を利用してそのような変化を検出します。このPCR後の分析法では、温度ランプ制御データキャプチャ機能を備え、96ウェルプレートフォーマットに容易にスケーリングできる計装付き蛍光二本鎖DNA結合色素を使用します。ここでは、CRISPR/Cas9誘導インデルの迅速な検出と蚊 Ae.aegyptiにおける突然変異線の確立のためのHRMAを使用した簡単なワークフローがあります。重要なことに、すべてのステップは少量の脚組織で行われ、生物を犠牲にする必要はなく、遺伝子型入力後に遺伝的十字架または表現型アッセイを行うことができます。
Introduction
デング熱1、ジカ2、チクングニア3 ウイルス、マラリア原虫4などの病原体のベクターとして、蚊は人間にとって重大な公衆衛生上の脅威を表しています。これらすべての疾患について、蚊のベクターの制御に伝染介入の実質的な焦点があります。例えば、病原体への寛容さ、蚊の適性、生存、生殖、殺虫剤に対する耐性に関する重要な遺伝子の研究は、新しい蚊対策戦略を開発するための鍵です。このような目的のために、蚊のゲノム編集は、特に、ES、ZFN、タリン、そして最近ではCas9を用いたCRISPRなどの技術の開発に伴い、一般的な習慣になりつつあります。遺伝子編集株の確立は、通常、オフターゲットおよび創始者(ボトルネック)効果を最小限に抑えるために数世代にわたり所望の突然変異を運ぶ個体を裏切り、続いてヘテロ接合個体を交えてホモ接合または異種間間線を生成することを含む。支配的なマーカーがない場合、多くの場合、ヘテロ接合性変異体に対して明確な形質の形質が検出されないため、このプロセスでは分子ジェノタイピングが必要です。
シーケンシングはジェロティピック特性評価のゴールドスタンダードですが、これを何百人、あるいは何千人もの個人にわたって行うことは、結果を得るのに必要な多大なコスト、労力、時間をもたらし、蚊などの寿命が短い生物にとって特に重要です。一般的に使用される選択肢は、測量ヌクレアーゼアッセイ5 (SNA)、T7E1アッセイ6、および高解像度メルト分析(HRMA、レビューイン7)です。SNA と T7E1 の両方で、不一致のベースのみを切断するエンドヌクレアーゼを使用します。ヘテロ接合変異体ゲノムの変異領域が増幅されると、変異型アレルと野生型対立遺伝子からのDNA断片がアニールされ、不一致の二本鎖DNA(dsDNA)が作られます。SNAは、ミスマッチ特異的なエンドヌクレアーゼと単純なアガロースゲル電気泳動による消化を介してミスマッチの存在を検出します。あるいは、HRMAはdsDNA結合蛍光色素によって検出されたdsDNAの熱力学的性質を使用し、変異の存在とタイプに基づいて色素の逆結合温度が変化する。HRMAは、一塩基多型(SNPs)8、シマウマ魚9の変異型遺伝子型、微生物学的用途10、植物遺伝子研究11の検出に使用されている。
本論文では、CRISPR/Cas9技術により生成される変異型蚊の分子ジェノタイピングの簡便な手法であるHRMAについて述べている。代替技術に対するHRMAの利点は、様々な遺伝子、幅広いインデルサイズ、異なるインデルサイズとヘテロ接合、ホモ接合、および異種性分化12、13、14、2)コストの区別に有用であることが証明されている1)柔軟性、および3時間短縮、および3時間短縮を含む。 それはほんの数時間で実行することができるので。さらに、このプロトコルはDNAの供給源として小さな身体部分(脚)を使用し、蚊がジェノタイピングプロセスを生き残ることを可能にし、突然変異線の確立および維持を可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
高解像度の溶融解析は、ベクター蚊Ae.aegyptiでCRISPR / Cas9技術によって生成されたインデルの同定のためのシンプルで迅速なソリューションを提供します。それは柔軟性を提供し、飛行筋肉から鉄代謝およびより多くへの遺伝子の広い範囲のために変異する蚊のジェノタイピングを可能にする13,14。HRMAはサンプル収集から最終分析までわずか数…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
すべての数字は、テキサスA&M大学へのライセンスの下で Biorender.com で作成されました.この研究は、国立アレルギー・感染症研究所(AI137112およびAI115138からZ.N.A.)、昆虫ベクター病グラントプログラムの下のテキサスA&M AgriLife研究、およびUSDA国立食品農業研究所の資金によって支えられ、ハッチプロジェクト1018401。
Materials
| 70% Ethanol | 70% ethanol solution in water | ||
| 96-well PCR and Real-time PCR plates | VWR | 82006-636 | For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg) |
| 96-well plate templates | House-made printed, for genotype recording | ||
| Bio Rad CFX96 | Bio Rad | PCR machine with gradient and HRMA capabilities | |
| Diversified Biotech reagent reservoirs | VWR | 490006-896 | |
| Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit | New England Biolabs | E1050S | |
| Glass Petri Dish | VWR | 89001-246 | 150 mm x 20 mm |
| Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates | Bio-rad | HSP9665 | For HRMA |
| Multi-channel pipettor (P10) | Integra Biosciences | 4721 | |
| Multi-channel pipettor (P300) | Integra Biosciences | 4723 | |
| Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific | VWR | 37000-548 | To use with the 96-well PCR plates for obtaining genomic DNA |
| Optical sealing tape | Bio-rad | 2239444 | To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA |
| Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) | Thermo Fisher | F140WH | For obtaining genomic DNA and performing PCR |
| Plastic Fly Vial Dividers | Genesee | 59-128W | |
| Precision Melt Analysis Software | Bio Rad | 1845025 | Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3) |
| SeqMan Pro | DNAstar Lasergene software | For multiple sequence alignment | |
| Single-channel pipettor | Gilson | ||
| Tweezers Dumont #5 11 cm | WPI | 14098 | |
| White foam plugs | VWR | 60882-189 | |
| Wide Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee | 32-117 | |
| Wide Fly Vial Tray, Blue | Genesee | 59-164B |
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