Detección indel tras mutagénesis CRISPR/Cas9 mediante análisis de fusión de alta resolución en el mosquito Aedes aegypti
Summary
Este artículo detalla un protocolo para la identificación rápida de indels inducidos por CRISPR/Cas9 y la selección de líneas mutantes en el mosquito Aedes aegypti utilizando análisis de fusión de alta resolución.
Abstract
La edición de genes de mosquitos se ha convertido en rutina en varios laboratorios con el establecimiento de sistemas como nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN), nucleasas de dedos de zinc (ZFN) y endonucleasas de homing (HE). Más recientemente, la tecnología de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) / proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9) ha ofrecido una alternativa más fácil y barata para la ingeniería genómica de precisión. Después de la acción de la nucleasa, las vías de reparación del ADN arreglarán los extremos rotos del ADN, a menudo introduciendo indels. Estas mutaciones fuera de marco se utilizan para comprender la función génica en los organismos objetivo. Un inconveniente, sin embargo, es que los individuos mutantes no llevan un marcador dominante, lo que hace que la identificación y el seguimiento de los alelos mutantes sean un desafío, especialmente a escalas necesarias para muchos experimentos.
El análisis de fusión de alta resolución (HRMA) es un método simple para identificar variaciones en las secuencias de ácidos nucleicos y utiliza curvas de fusión por PCR para detectar tales variaciones. Este método de análisis post-PCR utiliza colorantes fluorescentes de doble cadena de unión al ADN con instrumentación que tiene capacidad de captura de datos de control de rampa de temperatura y se escala fácilmente a formatos de placa de 96 pocillos. Aquí se describe un flujo de trabajo simple utilizando HRMA para la detección rápida de indels inducidos por CRISPR / Cas9 y el establecimiento de líneas mutantes en el mosquito Ae. aegypti. Críticamente, todos los pasos se pueden realizar con una pequeña cantidad de tejido de la pierna y no requieren sacrificar el organismo, lo que permite que se realicen cruces genéticos o ensayos de fenotipado después del genotipado.
Introduction
Como vectores de patógenos como los virus del dengue1, Zika2 y chikungunya3, así como de parásitos de la malaria4, los mosquitos representan una amenaza significativa para la salud pública de los seres humanos. Para todas estas enfermedades, hay un enfoque sustancial de la intervención de transmisión en el control de los mosquitos vectores. El estudio de los genes importantes en, por ejemplo, la permisividad a los patógenos, la aptitud de los mosquitos, la supervivencia, la reproducción y la resistencia a los insecticidas es clave para desarrollar nuevas estrategias de control de mosquitos. Para tales fines, la edición del genoma en mosquitos se está convirtiendo en una práctica común, especialmente con el desarrollo de tecnologías como HEs, ZFNs, TALENs y, más recientemente, CRISPR con Cas9. El establecimiento de cepas editadas genéticamente implica el retrocruce de individuos portadores de las mutaciones deseadas durante unas pocas generaciones para minimizar los efectos fuera del objetivo y fundadores (cuello de botella), seguido de cruzar individuos heterocigotos para generar líneas homocigotas o trans-heterocigotas. En ausencia de un marcador dominante, el genotipado molecular es necesario en este proceso porque, en muchos casos, no se pueden detectar rasgos fenotípicos claros para los mutantes heterocigotos.
Aunque la secuenciación es el estándar de oro para la caracterización genotípica, realizar esto en cientos, o posiblemente miles de individuos, plantea costos significativos, mano de obra y tiempo requerido para obtener resultados, lo cual es especialmente crítico para organismos con una vida útil corta, como los mosquitos. Las alternativas más utilizadas son el ensayo de nucleasa Surveyor5 (SNA), el ensayo T7E16 y el análisis de fusión de alta resolución (HRMA, revisado en7). Tanto SNA como T7E1 usan endonucleasas que cortan solo bases no coincidentes. Cuando se amplifica una región mutada del genoma mutante heterocigoto, los fragmentos de ADN de alelos mutantes y de tipo salvaje se recocen para hacer ADN de doble cadena (dsDNA) no coincidente. SNA detecta la presencia de desajustes a través de la digestión con una endonucleasa específica de desajuste y electroforesis simple en gel de agarosa. Alternativamente, HRMA utiliza las propiedades termodinámicas del dsDNA detectadas por los colorantes fluorescentes de unión al dsDNA, con la temperatura de disociación del colorante variando según la presencia y el tipo de mutación. La HRMA se ha utilizado para la detección de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs)8, genotipado mutante de peces cebra9, aplicaciones microbiológicas10 e investigación fitogenética11, entre otras.
Este artículo describe HRMA, un método simple de genotipado molecular para mosquitos mutantes generados por la tecnología CRISPR / Cas9. Las ventajas de hrMA sobre las técnicas alternativas incluyen 1) flexibilidad, ya que se ha demostrado que es útil para varios genes, una amplia gama de tamaños indel, así como la distinción entre diferentes tamaños de indel y diferenciación heterocigota, homocigota y trans-heterocigota12,13,14, 2) costo, ya que se basa en reactivos de PCR de uso común, y 3) ahorro de tiempo, ya que se puede realizar en tan solo unas horas. Además, el protocolo utiliza una pequeña parte del cuerpo (una pata) como fuente de ADN, lo que permite que el mosquito sobreviva al proceso de genotipado, lo que permite el establecimiento y mantenimiento de líneas mutantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
El análisis de fusión de alta resolución ofrece una solución simple y rápida para la identificación de indels generados por la tecnología CRISPR/Cas9 en el mosquito vector Ae. aegypti. Proporciona flexibilidad, permitiendo el genotipado de mosquitos mutados para una amplia gama de genes, desde el músculo de vuelo hasta el metabolismo del hierro y más13,14. La HRMA se puede realizar en solo unas pocas horas desde la recolección de la muestra has…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Todas las figuras fueron creadas con Biorender.com bajo una licencia de la Universidad de Texas A&M. Este trabajo fue apoyado por fondos del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (AI137112 y AI115138 a Z.N.A.), Texas A&M AgriLife Research bajo el Programa de Subvenciones para Enfermedades Insectarias Vectorizadas, y el Proyecto Hatch del Instituto Nacional de Alimentos y Agricultura del USDA, 1018401.
Materials
| 70% Ethanol | 70% ethanol solution in water | ||
| 96-well PCR and Real-time PCR plates | VWR | 82006-636 | For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg) |
| 96-well plate templates | House-made printed, for genotype recording | ||
| Bio Rad CFX96 | Bio Rad | PCR machine with gradient and HRMA capabilities | |
| Diversified Biotech reagent reservoirs | VWR | 490006-896 | |
| Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit | New England Biolabs | E1050S | |
| Glass Petri Dish | VWR | 89001-246 | 150 mm x 20 mm |
| Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates | Bio-rad | HSP9665 | For HRMA |
| Multi-channel pipettor (P10) | Integra Biosciences | 4721 | |
| Multi-channel pipettor (P300) | Integra Biosciences | 4723 | |
| Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific | VWR | 37000-548 | To use with the 96-well PCR plates for obtaining genomic DNA |
| Optical sealing tape | Bio-rad | 2239444 | To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA |
| Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) | Thermo Fisher | F140WH | For obtaining genomic DNA and performing PCR |
| Plastic Fly Vial Dividers | Genesee | 59-128W | |
| Precision Melt Analysis Software | Bio Rad | 1845025 | Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3) |
| SeqMan Pro | DNAstar Lasergene software | For multiple sequence alignment | |
| Single-channel pipettor | Gilson | ||
| Tweezers Dumont #5 11 cm | WPI | 14098 | |
| White foam plugs | VWR | 60882-189 | |
| Wide Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee | 32-117 | |
| Wide Fly Vial Tray, Blue | Genesee | 59-164B |
References
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