Indel الكشف بعد CRISPR / Cas9 Mutagenesis باستخدام تحليل ذوبان عالية الدقة في Aedes البعوض aegypti
Summary
هذه المادة تفاصيل بروتوكول لتحديد سريع من indels الناجمة عن CRISPR / Cas9 واختيار خطوط متحولة في Aedes aegypti البعوض باستخدام تحليل ذوبان عالية الدقة.
Abstract
أصبح تحرير الجينات البعوض روتينية في العديد من المختبرات مع إنشاء نظم مثل النسخ المنشط مثل النوى تأثير (TALENs)، نواة الزنك إصبع (ZFNs)، وتوجيه الإندونوكلياس (HEs). وفي الآونة الأخيرة، قدمت تكنولوجيا البروتين 9 (Cas9) المترابطة بانتظام القصيرة المترابطة (CRISPR)/CRISPR المرتبطة بالبروتين 9 (Cas9) بديلا أسهل وأرخص لهندسة الجينوم الدقيقة. بعد عمل النيوكليز، سوف إصلاح مسارات إصلاح الحمض النووي إصلاح نهايات الحمض النووي مكسورة، وإدخال indels في كثير من الأحيان. ثم تستخدم هذه الطفرات خارج الإطار لفهم وظيفة الجينات في الكائنات الحية المستهدفة. ومع ذلك، فإن العيب هو أن الأفراد المتحولين لا يحملون علامة مهيمنة، مما يجعل تحديد وتتبع الأليل المتحولة أمرا صعبا، خاصة على المقاييس اللازمة للعديد من التجارب.
تحليل ذوبان عالية الدقة (HRMA) هو وسيلة بسيطة لتحديد الاختلافات في تسلسل الحمض النووي ويستخدم منحنيات ذوبان PCR للكشف عن مثل هذه الاختلافات. تستخدم طريقة تحليل ما بعد PCR هذه الأصباغ الفلورية المزدوجة الملزمة للحمض النووي مع أجهزة لديها قدرة على التقاط البيانات التحكم في درجة الحرارة ويتم تحجيمها بسهولة إلى تنسيقات 96 لوحة جيدة. وصف هنا هو سير عمل بسيط باستخدام HRMA للكشف السريع عن كريسبر / Cas9 الناجمة عن indels وإنشاء خطوط متحولة في Ae. aegypti البعوض. بشكل حاسم ، يمكن تنفيذ جميع الخطوات مع كمية صغيرة من أنسجة الساق ولا تتطلب التضحية بالكائن الحي ، مما يسمح بإجراء الصلبان الوراثية أو المقايسات الفينوتيبينج بعد الكتابة الجينية.
Introduction
وباعتبار البعوض نواقل لمسببات الأمراض مثل فيروسات حمى الضنك 1 وزيكا 2 وشيكونغونيا3 ، فضلا عن طفيليات الملاريا4، فإن البعوض يمثل تهديدا كبيرا للصحة العامة للبشر. وبالنسبة لجميع هذه الأمراض، هناك تركيز كبير للتدخل في انتقال العدوى على مكافحة ناقلات البعوض. دراسة الجينات الهامة في، على سبيل المثال، التساهل مع مسببات الأمراض، واللياقة البدنية للبعوض، والناجية، والتكاثر، ومقاومة المبيدات الحشرية أمر أساسي لوضع استراتيجيات جديدة لمكافحة البعوض. ولهذه الأغراض، أصبح تحرير الجينوم في البعوض ممارسة شائعة، لا سيما مع تطوير تكنولوجيات مثل HEs و ZFNs و TALENs ومؤخرا CRISPR مع Cas9. إنشاء سلالات تحرير الجينات ينطوي عادة على الأفراد backcrossing تحمل الطفرات المطلوبة لبضعة أجيال للحد من الآثار خارج الهدف ومؤسس (عنق الزجاجة) ، تليها عبور الأفراد heterozygous لتوليد خطوط homozygous أو عبر heterozygous. في غياب علامة مهيمنة ، من الضروري الكتابة الجينية الجزيئية في هذه العملية لأنه ، في كثير من الحالات ، لا يمكن الكشف عن سمات واضحة فينوتيبيك للمسوخ heterozygous.
على الرغم من أن التسلسل هو المعيار الذهبي لتوصيف الجينية ، فإن تنفيذ ذلك عبر المئات ، أو ربما الآلاف من الأفراد ، يفرض تكاليف كبيرة ، والعمالة ، والوقت اللازم للحصول على النتائج ، وهو أمر بالغ الأهمية للكائنات الحية ذات العمر القصير مثل البعوض. البدائل شائعة الاستخدام هي المساح النيوكليز assay5 (SNA)، T7E1 المقايسة6، وتحليل ذوبان عالية الدقة (HRMA، استعرضت in7). كل من SNA و T7E1 استخدام endonucleases التي تلتصق قواعد غير متطابقة فقط. عندما يتم تضخيم منطقة متحولة من الجينوم المتحول heterozygous ، يتم تضخيم شظايا الحمض النووي من الأليل المتحولة والبرية لجعل الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل غير متطابقة (dsDNA). SNA يكشف عن وجود عدم التطابق عن طريق الهضم مع الإندونوكلياز عدم التطابق محددة وبسيطة agarose هلام الكهربائي. بدلا من ذلك، يستخدم HRMA الخصائص الديناميكية الحرارية ل dsDNA التي تم اكتشافها بواسطة الأصباغ الفلورية الملزمة dsDNA، مع اختلاف درجة حرارة فصل الصبغة استنادا إلى وجود ونوع الطفرة. وقد استخدمت HRMA للكشف عن تعدد الأشكال أحادية النيوكليوتيدات (SNPs)8، وال جينوتيب متحولة من حمار وحشي fish9، التطبيقات الميكروبيولوجية10، والبحوث الوراثية النباتية11، من بين أمور أخرى.
تصف هذه الورقة HRMA ، وهي طريقة بسيطة للجنوة الجزيئية للبعوض المتحول الناتج عن تقنية CRISPR /Cas9. مزايا HRMA على التقنيات البديلة تشمل 1) المرونة، كما ثبت أنها مفيدة لمختلف الجينات، ومجموعة واسعة من أحجام indel، فضلا عن التمييز بين أحجام indel مختلفة و heterozygous، homozygous، وعبر heterozygous differentiation12،13،14، 2) التكلفة، كما أنها تقوم على الكواشف PCR المستخدمة عادة، و 3) توفير الوقت، كما يمكن أن يؤديها في غضون ساعات قليلة. بالإضافة إلى ذلك ، يستخدم البروتوكول جزءا صغيرا من الجسم (ساقا) كمصدر للحمض النووي ، مما يسمح للبعوض بالبقاء على قيد الحياة في عملية الكتابة الجينية ، مما يسمح بإنشاء وصيانة خطوط متحولة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحليل ذوبان عالية الدقة يقدم حلا بسيطا وسريعا لتحديد indels التي تم إنشاؤها بواسطة تكنولوجيا CRISPR / Cas9 في البعوض ناقلات Ae. aegypti. وهو يوفر المرونة، مما يتيح جنوة البعوض تحور لمجموعة واسعة من الجينات من عضلات الطيران إلى استقلاب الحديد وأكثر13،14. يمكن إجراء HRMA …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم إنشاء جميع الأرقام مع Biorender.com بموجب ترخيص لجامعة تكساس A &؛ M. تم دعم هذا العمل من خلال أموال من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (AI137112 وAI115138 إلى Z.N.A.) ، وتكساس A & M AgriLife Research في إطار برنامج منحة الأمراض الموجهة الحشرية ، والمعهد الوطني للأغذية والزراعة في وزارة الزراعة الأمريكية ، مشروع هاتش 1018401.
Materials
| 70% Ethanol | 70% ethanol solution in water | ||
| 96-well PCR and Real-time PCR plates | VWR | 82006-636 | For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg) |
| 96-well plate templates | House-made printed, for genotype recording | ||
| Bio Rad CFX96 | Bio Rad | PCR machine with gradient and HRMA capabilities | |
| Diversified Biotech reagent reservoirs | VWR | 490006-896 | |
| Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit | New England Biolabs | E1050S | |
| Glass Petri Dish | VWR | 89001-246 | 150 mm x 20 mm |
| Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates | Bio-rad | HSP9665 | For HRMA |
| Multi-channel pipettor (P10) | Integra Biosciences | 4721 | |
| Multi-channel pipettor (P300) | Integra Biosciences | 4723 | |
| Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific | VWR | 37000-548 | To use with the 96-well PCR plates for obtaining genomic DNA |
| Optical sealing tape | Bio-rad | 2239444 | To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA |
| Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) | Thermo Fisher | F140WH | For obtaining genomic DNA and performing PCR |
| Plastic Fly Vial Dividers | Genesee | 59-128W | |
| Precision Melt Analysis Software | Bio Rad | 1845025 | Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3) |
| SeqMan Pro | DNAstar Lasergene software | For multiple sequence alignment | |
| Single-channel pipettor | Gilson | ||
| Tweezers Dumont #5 11 cm | WPI | 14098 | |
| White foam plugs | VWR | 60882-189 | |
| Wide Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee | 32-117 | |
| Wide Fly Vial Tray, Blue | Genesee | 59-164B |
References
- WHO. Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. WHO. , 160 (2009).
- WHO. Zika epidemiology update. WHO. , 1-13 (2019).
- WHO. Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever. WHO. , (2009).
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791 (2020)
- Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
- Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection. Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).
- Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Tong, S. Y., Giffard, P. M. Microbiological applications of high-resolution melting analysis. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).
- Simko, I. High-resolution DNA melting analysis in plant research. Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).
- Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).
- O’Leary, S., Adelman, Z. N. CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971 (2020).
- Kojin, B. B., et al. Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands. Malaria Journal. 20 (1), 11 (2021).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Larkin, M. A., et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).
- Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316 (2017).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).
