Indel-Nachweis nach CRISPR/Cas9-Mutagenese mittels hochauflösender Schmelzeanalyse in der Mücke Aedes aegypti

Als Vektoren von Krankheitserregern wie ^Dengue1-, ^Zika2– und Chikungunya3-Viren sowie Malariaparasiten4 stellen Moskitos eine erhebliche Bedrohung für die öffentliche Gesundheit des Menschen dar. Bei all diesen Erkrankungen liegt ein wesentlicher Schwerpunkt der Übertragungsintervention auf der Bekämpfung von Mückenvektoren. Die Untersuchung der Gene, die beispielsweise für die Permissivität gegenüber Krankheitserregern, die Fitness von Mücken, das Überleben, die Fortpflanzung und die Resistenz gegen Insektizide wichtig sind, ist der Schlüssel zur Entwicklung neuartiger Strategien zur Bekämpfung von Mücken. Für solche Zwecke wird die Genom-Editierung bei Moskitos zu einer gängigen Praxis, insbesondere mit der Entwicklung von Technologien wie HEs, ZFNs, TALENs und zuletzt CRISPR mit Cas9. Die Etablierung von geneditierten Stämmen beinhaltet typischerweise die Rückkreuzung von Individuen, die die gewünschten Mutationen für einige Generationen tragen, um Off-Target- und Gründer- (Engpass-) Effekte zu minimieren, gefolgt von der Kreuzung heterozygoter Individuen, um homozygote oder trans-heterozygote Linien zu erzeugen. In Ermangelung eines dominanten Markers ist in diesem Prozess eine molekulare Genotypisierung notwendig, da in vielen Fällen keine eindeutigen phänotypischen Merkmale für heterozygote Mutanten nachgewiesen werden können.

Obwohl die Sequenzierung der Goldstandard für die genotypische Charakterisierung ist, stellt die Durchführung bei Hunderten oder möglicherweise Tausenden von Individuen erhebliche Kosten, Arbeit und Zeit dar, die erforderlich sind, um Ergebnisse zu erzielen, was besonders für Organismen mit kurzer Lebensdauer wie Moskitos von entscheidender Bedeutung ist. Häufig verwendete Alternativen sind Surveyor Nuclease ^Assay5 (SNA), T7E1 ^Assay6 und High Resolution Melt Analysis (HRMA, überprüft ⁱⁿ⁷). Sowohl SNA als auch T7E1 verwenden Endonukleasen, die nur nicht übereinstimmende Basen spalten. Wenn eine mutierte Region des heterozygoten mutanten Genoms amplifiziert wird, werden DNA-Fragmente von mutierten und Wildtyp-Allelen geglüht, um eine nicht übereinstimmende doppelsträngige DNA (dsDNA) herzustellen. SNA erkennt das Vorhandensein von Mismatches über die Verdauung mit einer Mismatch-spezifischen Endonuklease und einer einfachen Agarosegelelektrophorese. Alternativ nutzt HRMA die thermodynamischen Eigenschaften von dsDNA, die durch dsDNA-bindende Fluoreszenzfarbstoffe nachgewiesen werden, wobei die Dissoziationstemperatur des Farbstoffs je nach Vorhandensein und Art der Mutation variiert. HRMA wurde unter anderem für den Nachweis von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs)⁸, die mutierte Genotypisierung von Zebrafischen9, mikrobiologische ^{Anwendungen10} und pflanzengenetische ^Forschung11 eingesetzt.

Dieser Artikel beschreibt HRMA, eine einfache Methode der molekularen Genotypisierung für mutierte Moskitos, die durch die CRISPR / Cas9-Technologie erzeugt werden. Zu den Vorteilen von HRMA gegenüber alternativen Techniken gehören 1) Flexibilität, da sie sich für verschiedene Gene als nützlich erwiesen hat, eine breite Palette von Indelgrößen sowie die Unterscheidung zwischen verschiedenen Indelgrößen und heterozygoter, homozygoter und trans-heterozygoter Differenzierung12,13,14, 2) Kosten, da sie auf häufig verwendeten PCR-Reagenzien basiert, und 3) Zeitersparnis, da es in nur wenigen Stunden durchgeführt werden kann. Darüber hinaus verwendet das Protokoll einen kleinen Körperteil (ein Bein) als DNA-Quelle, so dass die Mücke den Genotypisierungsprozess überleben kann, was die Etablierung und Aufrechterhaltung von Mutantenlinien ermöglicht.