Rilevamento Indel a seguito della mutagenesi CRISPR/Cas9 mediante analisi della fusione ad alta risoluzione nell'aegittito di Mosquito Aedes
Summary
Questo articolo descrive in dettaglio un protocollo per la rapida identificazione degli indel indotti da CRISPR / Cas9 e la selezione delle linee mutanti nella zanzara Aedes aegypti utilizzando l’analisi del fuso ad alta risoluzione.
Abstract
L’editing genetico delle zanzare è diventato di routine in diversi laboratori con la creazione di sistemi come le nucleasi effettori simili a stimolatori di trascrizione (TALEN), le nucleasi a dita di zinco (ZFN) e le endonucleasi di homing (HE). Più recentemente, la tecnologia CRISPR (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) aggregolate regolarmente intervallate ha offerto un’alternativa più semplice ed economica per l’ingegneria del genoma di precisione. Seguendo l’azione della nucleasi, i percorsi di riparazione del DNA risolveranno le estremità del DNA rotte, spesso introducendo indel. Queste mutazioni fuori dal quadro vengono quindi utilizzate per comprendere la funzione genica negli organismi bersaglio. Uno svantaggio, tuttavia, è che gli individui mutanti non portano marcatori dominanti, rendendo difficile l’identificazione e il tracciamento degli alleli mutanti, specialmente alle scale necessarie per molti esperimenti.
L’analisi della fusione ad alta risoluzione (HRMA) è un metodo semplice per identificare le variazioni nelle sequenze di acidi nucleici e utilizza le curve di fusione pcr per rilevare tali variazioni. Questo metodo di analisi post-PCR utilizza coloranti fluorescenti a doppio filamento che legano il DNA con strumentazione che ha capacità di acquisizione dei dati di controllo della rampa di temperatura ed è facilmente scalabile a formati di piastre a 96 pozzetti. Qui è descritto un semplice flusso di lavoro che utilizza HRMA per il rilevamento rapido di indel indotti da CRISPR / Cas9 e la creazione di linee mutanti nella zanzara Ae. aegypti. Criticamente, tutti i passaggi possono essere eseguiti con una piccola quantità di tessuto delle gambe e non richiedono il sacrificio dell’organismo, consentendo l’esecuzione di incroci genetici o saggi di fenotipizzazione dopo la genotipizzazione.
Introduction
Come vettori di agenti patogeni come i virus dengue1, Zika2 e chikungunya3, nonché i parassiti malarici4, le zanzare rappresentano una significativa minaccia per la salute pubblica umana. Per tutte queste malattie, c’è un focus sostanziale dell’intervento di trasmissione sul controllo dei vettori di zanzare. Lo studio dei geni importanti, ad esempio, per il permissivismo nei confronti degli agenti patogeni, la forma fisica delle zanzare, la sopravvivenza, la riproduzione e la resistenza agli insetticidi è fondamentale per lo sviluppo di nuove strategie di controllo delle zanzare. Per tali scopi, l’editing del genoma nelle zanzare sta diventando una pratica comune, specialmente con lo sviluppo di tecnologie come HEs, ZFN, TALEN e, più recentemente, CRISPR con Cas9. La creazione di ceppi geneticamente modificati comporta tipicamente il backcrossing di individui portatori delle mutazioni desiderate per alcune generazioni per ridurre al minimo gli effetti off-target e founder (collo di bottiglia), seguiti dall’incrocio di individui eterozigoti per generare linee omozigoti o trans-eterozigoti. In assenza di un marcatore dominante, la genotipizzazione molecolare è necessaria in questo processo perché, in molti casi, non è possibile rilevare tratti fenotipici chiari per i mutanti eterozigoti.
Sebbene il sequenziamento sia il gold standard per la caratterizzazione genotipica, l’esecuzione di questo su centinaia, o forse migliaia di individui, pone costi significativi, manodopera e tempo necessari per ottenere risultati, il che è particolarmente critico per gli organismi con una vita breve come le zanzare. Le alternative comunemente utilizzate sono surveyor nuclease assay5 (SNA), T7E1 assay6 e analisi della fusione ad alta risoluzione (HRMA, recensito in7). Sia SNA che T7E1 utilizzano endonucleasi che scindere solo basi non corrispondenti. Quando una regione mutata del genoma mutante eterozigote viene amplificata, i frammenti di DNA di alleli mutanti e wild-type vengono ricotti per produrre DNA a doppio filamento (dsDNA) non corrispondente. SNA rileva la presenza di disallineamenti attraverso la digestione con un’endonucleasi specifica per la mancata corrispondenza e una semplice elettroforesi su gel di agarosio. In alternativa, HRMA utilizza le proprietà termodinamiche del dsDNA rilevate dai coloranti fluorescenti leganti il dsDNA, con la temperatura di dissociazione del colorante che varia in base alla presenza e al tipo di mutazione. HRMA è stato utilizzato per il rilevamento di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP)8, genotipizzazione mutante di pesci zebra9, applicazioni microbiologiche10 e ricerca genetica vegetale11, tra gli altri.
Questo articolo descrive l’HRMA, un semplice metodo di genotipizzazione molecolare per le zanzare mutanti generato dalla tecnologia CRISPR/Cas9. I vantaggi dell’HRMA rispetto alle tecniche alternative includono 1) flessibilità, in quanto si è dimostrato utile per vari geni, una vasta gamma di dimensioni indel, nonché la distinzione tra diverse dimensioni indel e differenziazione eterozigote, omozigote e trans-eterozigote12,13,14, 2) costo, in quanto si basa su reagenti PCR comunemente usati e 3) risparmio di tempo, in quanto può essere eseguito in poche ore. Inoltre, il protocollo utilizza una piccola parte del corpo (una gamba) come fonte di DNA, consentendo alla zanzara di sopravvivere al processo di genotipizzazione, consentendo la creazione e il mantenimento di linee mutanti.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’analisi del fuso ad alta risoluzione offre una soluzione semplice e veloce per l’identificazione di indels generati dalla tecnologia CRISPR/Cas9 nella zanzara vettore Ae. aegypti. Fornisce flessibilità, consentendo la genotipizzazione delle zanzare mutate per una vasta gamma di geni dal muscolo di volo al metabolismo del ferro e altro ancora13,14. L’HRMA può essere eseguito in poche ore dalla raccolta dei campioni alle analisi finali. È necessario u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tutte le figure sono state create con Biorender.com sotto licenza alla Texas A & M University. Questo lavoro è stato supportato da fondi del National Institute of Allergy and Infectious Disease (AI137112 e AI115138 a Z.N.A.), Texas A & M AgriLife Research nell’ambito del programma Insect Vectored Disease Grant e USDA National Institute of Food and Agriculture, progetto Hatch 1018401.
Materials
| 70% Ethanol | 70% ethanol solution in water | ||
| 96-well PCR and Real-time PCR plates | VWR | 82006-636 | For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg) |
| 96-well plate templates | House-made printed, for genotype recording | ||
| Bio Rad CFX96 | Bio Rad | PCR machine with gradient and HRMA capabilities | |
| Diversified Biotech reagent reservoirs | VWR | 490006-896 | |
| Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit | New England Biolabs | E1050S | |
| Glass Petri Dish | VWR | 89001-246 | 150 mm x 20 mm |
| Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates | Bio-rad | HSP9665 | For HRMA |
| Multi-channel pipettor (P10) | Integra Biosciences | 4721 | |
| Multi-channel pipettor (P300) | Integra Biosciences | 4723 | |
| Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific | VWR | 37000-548 | To use with the 96-well PCR plates for obtaining genomic DNA |
| Optical sealing tape | Bio-rad | 2239444 | To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA |
| Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) | Thermo Fisher | F140WH | For obtaining genomic DNA and performing PCR |
| Plastic Fly Vial Dividers | Genesee | 59-128W | |
| Precision Melt Analysis Software | Bio Rad | 1845025 | Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3) |
| SeqMan Pro | DNAstar Lasergene software | For multiple sequence alignment | |
| Single-channel pipettor | Gilson | ||
| Tweezers Dumont #5 11 cm | WPI | 14098 | |
| White foam plugs | VWR | 60882-189 | |
| Wide Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee | 32-117 | |
| Wide Fly Vial Tray, Blue | Genesee | 59-164B |
References
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