Preparação e implantação de eletrodos para kindling elétrico de camundongos VGAT-CRE para gerar um modelo para epilepsia do lobo temporal
Summary
Este relato descreve os métodos para gerar um modelo de epilepsia do lobo temporal baseado no kindling elétrico de camundongos VGAT-Cre transgênicos. Camundongos VGAT-Cre acesos podem ser úteis para determinar o que causa epilepsia e para rastrear novas terapias.
Abstract
Descobriu-se que o kindling elétrico de camundongos VGAT-Cre levou a convulsões motoras e eletrográficas espontâneas. Um artigo recente concentrou-se em como camundongos VGAT-Cre únicos foram usados no desenvolvimento de convulsões recorrentes espontâneas (SRS) após o kindling e um provável mecanismo – inserção de Cre no gene VGAT – interrompeu sua expressão e reduziu o tônus gabaérgico. O presente estudo estende essas observações a uma coorte maior de camundongos, concentrando-se em questões-chave, como quanto tempo o SRS continua após o acender e o efeito do sexo e da idade do animal. Este relato descreve os protocolos para as seguintes etapas principais: confecção de fones de ouvido com eletrodos de profundidade hipocampal para estimulação elétrica e leitura do eletroencefalograma; cirurgia para fixar o fone de ouvido de forma segura no crânio do mouse para que ele não caia; e os principais detalhes do protocolo de kindling elétrico, como duração do pulso, frequência do trem, duração do trem e quantidade de corrente injetada. O protocolo de kindling é robusto na medida em que conduz de forma confiável à epilepsia na maioria dos camundongos VGAT-Cre, fornecendo um novo modelo para testar novas drogas antiepileptogênicas.
Introduction
A epilepsia é um importante distúrbio neurológico com significativos encargos econômicos e humanos. O NINDS estima que existam 3 milhões de americanos com epilepsia. Aproximadamente 0,6 milhão desses pacientes apresentam epilepsia do lobo temporal (ELT)1. Infelizmente, o tratamento clínico da ELT falha em um terço dos pacientes devido à ineficácia, desenvolvimento de resistência aos medicamentos ou intolerância aos efeitos colaterais2. Claramente, há uma necessidade significativa de desenvolver novas terapias para ELT, uma conclusão compartilhada pelo Comitê de Ciência Básica da Sociedade Americana de Epilepsia, pelo Grupo de Trabalho da Liga Internacional Contra a Epilepsia para a Descoberta de Drogas Pré-Clínicas para Epilepsia e pelo Conselho Nacional Consultivo de Distúrbios Neurológicos e AVC 3,4.
Os modelos animais atuais de epilepsia do lobo temporal utilizam quimioconvulsivantes (por exemplo, cainato, pilocarpina) ou estimulação elétrica prolongada para induzir um estado de mal epiléptico de longa duração 5,6,7. Muitos animais morrem durante o procedimento (10%-30% em ratos, até 90% em camundongos8). Animais que sobrevivem e desenvolvem epilepsia apresentam morte neuronal extensa em todo o encéfalo 9,10. Essa morte desencadeia uma cascata de respostas, começando com a ativação de micróglias, astrócitos e monócitos infiltrantes. As respostas neuronais incluem reorganização de circuitos (por exemplo, brotamento de fibras musgosas), nascimento de novos neurônios que não conseguem se integrar adequadamente em circuitos (por exemplo, células de grânulos ectópicos) e mudanças intrínsecas que levam à hiperexcitabilidade (por exemplo, upregulation de canais de Na+). Um modelo de epilepsia sem morte neuronal significativa facilitará a busca de novas drogas antiepilépticas.
Ao testar a hipótese GABA de epilepsia, descobriu-se que o tratamento de camundongos VGAT-Cre com um protocolo leve de kindling elétrico levou a convulsões motoras e eletrográficas espontâneas11. Em geral, o kindling elétrico de roedores não leva a crises espontâneas que definem epilepsia, embora possa, em casos de over-kindling11. Camundongos VGAT-Cre expressam Cre recombinase sob o controle do gene transportador vesicular de GABA (VGAT), que é especificamente expresso em neurônios inibitórios GABAérgicos. Verificou-se que a inserção de Cre interrompeu a expressão de VGAT nos níveis de RNAm e proteína, prejudicando assim a transmissão sináptica GABAérgica no hipocampo. Concluiu-se que camundongos VGAT-Cre acesos podem ser úteis para estudar os mecanismos envolvidos na epileptogênese e para a triagem de novas terapêuticas11. O presente relatório fornece os métodos usados na geração do modelo em detalhes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este relato descreve um protocolo em que o acender elétrico de camundongos leva à epilepsia. Uma vez que o eletrodo estimulador é colocado no hipocampo, esta é uma epilepsia límbica focal que modela a epilepsia do lobo temporal (ELT) em pacientes. Um passo crítico neste protocolo é a utilização de camundongos VGAT-Cre, que devido à inserção de um de recombinase IRES-Cre no gene Vgat , apresenta comprometimento das correntes inibitórias doGABA11. C57BL/6 não desenvolvem epile…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a John Williamson pelas discussões úteis sobre este protocolo. Este trabalho foi apoiado pelo NIH/NINDS grant NS112549.
Materials
| 16 Channel Extracellular Differential AC Amplifier (115V/60Hz) | AD Instruments | AM3500-115-60 | Alternate EEG amplifier |
| 363/CP PLUG COLLAR, PINS SLEEVE | P1 Technologies | 363SLEEVPIN0NL | For electrode holder |
| Cable, 363-363 5CM – 100CM W/MESH 6TCM | P1 Technologies | 363363XXXXCM004 | mouse-to-commutator cable |
| CCTV cameras Qcwox HD Sony IR LED | Sony | QC-SP316 | |
| Commutator SL6C/SB (single brush) | P1 Technologies | 8BSL6CSBC0MT | formerly Plastics One, Inc. |
| Current amplifier | A-M Systems | Model 2100 | |
| Dental cement | Stoelting | 51459 | |
| Drill bits, #75, OD 0.310" LOC 130 PT | Kyocera | 105-0210.310 | |
| E363/0 SOCKET CONTACT SKEWED | P1 Technologies | 8IE3630XXXXE | pins for connector |
| iBond Self Etch glue | Kulzer | CE0197 | |
| MS363 PEDESTAL 2298 6 PIN WHITE | P1 Technologies | 8K000229801F | EEG headset connector |
| Ohmeter | Simpson | 260 | High sensitivity |
| PowerLab 16/35 and LabChart Pro | AD Instruments | PL3516/P | Alternate EEG software |
| SomnoSuite | Kent Scientific Corp. | SS-01 | anesthesia unit & RightTemp monitoring |
| Stereotactic drill and micromotor kit | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
| Stereotactic frame | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Teflon-coated wire for depth electrode, OD 0.008' | A-M Systems | 791400 | |
| VGAT-Cre mice on congenic C57BL/6J background | The Jackson Laboratory | 000664 |
References
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