הכנה והשתלה של אלקטרודות להצתה חשמלית של עכברי VGAT-Cre ליצירת מודל לאפילפסיה של האונה הרקתית
Summary
דו”ח זה מתאר את השיטות ליצירת מודל של אפילפסיה של האונה הרקתית המבוסס על הצתה חשמלית של עכברי VGAT-Cre טרנסגניים. עכברי VGAT-Cre עשויים להיות שימושיים בקביעת הגורמים לאפילפסיה ולהקרנת טיפולים חדשניים.
Abstract
התגלה כי הצתה חשמלית של עכברי VGAT-Cre הובילה להתקפים מוטוריים ואלקטרוגרפיים ספונטניים. מאמר שפורסם לאחרונה התמקד באופן שבו עכברי VGAT-Cre ייחודיים שימשו בפיתוח התקפים חוזרים ספונטניים (SRS) לאחר הדלקה, ומנגנון סביר – החדרת Cre לגן VGAT – שיבש את ביטויו והפחית את הטון GABAergic. המחקר הנוכחי מרחיב את התצפיות הללו לקבוצה גדולה יותר של עכברים, תוך התמקדות בסוגיות מפתח כגון כמה זמן נמשך ה-SRS לאחר ההדלקה והשפעת המין והגיל של החיה. דוח זה מתאר את הפרוטוקולים עבור השלבים העיקריים הבאים: יצירת אוזניות עם אלקטרודות עומק בהיפוקמפוס לגירוי חשמלי ולקריאת האלקטרואנצפלוגרמה; ניתוח כדי להדביק את האוזנייה בבטחה על גולגולת העכבר כך שהוא לא נופל; ופרטים מרכזיים של פרוטוקול הדלקה חשמלית כגון משך הדופק, תדירות הרכבת, משך הרכבת וכמות הזרם המוזרק. פרוטוקול ההדלקה חזק בכך שהוא מוביל באופן אמין לאפילפסיה ברוב עכברי VGAT-Cre, ומספק מודל חדש לבדיקת תרופות אנטי-אפילפטוגניות חדשות.
Introduction
אפילפסיה היא הפרעה נוירולוגית גדולה עם נטל כלכלי ואנושי משמעותי. NINDS מעריך כי ישנם 3 מיליון אמריקאים עם אפילפסיה. כ-0.6 מיליון מהחולים האלה סובלים מאפילפסיה של האונה הרקתית (TLE)1. למרבה הצער, טיפול רפואי ב-TLE נכשל בשליש מהחולים בגלל חוסר יעילות, התפתחות עמידות לתרופות או חוסר סבילות לתופעות לוואי2. ברור שיש צורך משמעותי לפתח טיפולים חדשניים ל-TLE, מסקנה המשותפת לוועדת המדע הבסיסי של האגודה האמריקאית לאפילפסיה, קבוצת העבודה של הליגה הבינלאומית נגד אפילפסיה לגילוי תרופות פרה-קליניות לאפילפסיה, והמועצה הלאומית המייעצת להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי 3,4.
מודלים עכשוויים של בעלי חיים של אפילפסיה של האונה הרקתית משתמשים בכימוקונפרכוסים (למשל, קאינאט, פילוקרפין) או בגירוי חשמלי ממושך כדי לגרום לאפילפטיקוס סטטוס ארוך טווח 5,6,7. בעלי חיים רבים מתים במהלך ההליך (10%-30% בחולדות, עד 90% בעכברים8). בעלי חיים ששורדים ומפתחים אפילפסיה מראים מוות עצבי נרחב ברחבי המוח 9,10. מוות זה מעורר שרשרת של תגובות, החל מהפעלת מיקרוגליה, אסטרוציטים ומונוציטים חודרים. תגובות עצביות כוללות ארגון מחדש של מעגלים (למשל, הנבטת סיבי טחב), לידה של תאי עצב חדשים שאינם מצליחים להשתלב כראוי במעגלים (למשל, תאי גרגיר חוץ רחמי), ושינויים מהותיים שמובילים לרגישות יתר (למשל, הגברת הוויסות של תעלות Na+). מודל אפילפסיה ללא מוות עצבי משמעותי יקל על החיפוש אחר תרופות אנטי-אפילפטיות חדשות.
בעת בחינת השערת GABA של אפילפסיה, התגלה כי טיפול בעכברי VGAT-Cre עם פרוטוקול הדלקה חשמלית קלה הוביל להתקפים מוטוריים ואלקטרוגרפיים ספונטניים11. באופן כללי, הדלקה חשמלית של מכרסמים אינה מובילה להתקפים ספונטניים המגדירים אפילפסיה, אם כי היא יכולה, במקרים של הדלקת יתר11. עכברי VGAT-Cre מבטאים Cre recombinase תחת שליטת הגן המוביל GABA שלפוחית (VGAT), אשר מתבטא באופן ספציפי בנוירונים מעכבי GABAergic. נמצא כי החדרת Cre שיבשה את הביטוי של VGAT ברמת ה-mRNA והחלבון, ובכך פגעה בשידור הסינפטי GABAergic בהיפוקמפוס. המסקנה הייתה כי עכברי VGAT-Cre עשויים להיות שימושיים לחקר המנגנונים המעורבים באפילפטוגנזה ולהקרנת טיפולים חדשניים11. הדו”ח הנוכחי מספק בפירוט את השיטות המשמשות ליצירת המודל.
Protocol
Representative Results
Discussion
דו”ח זה מתאר פרוטוקול שבו הצתה חשמלית של עכברים מובילה לאפילפסיה. מאחר שהאלקטרודה המגרה ממוקמת בהיפוקמפוס, זוהי אפילפסיה לימבית מוקדית המדמה אפילפסיה של האונה הרקתית (TLE) בחולים. שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא להשתמש בעכברי VGAT-Cre, אשר עקב החדרת קלטת IRES-Cre recombinase בגן Vgat , מראה זרמי GABA מעכבים ל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לג’ון ויליאמסון על דיונים מועילים על פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH/NINDS NS112549.
Materials
| 16 Channel Extracellular Differential AC Amplifier (115V/60Hz) | AD Instruments | AM3500-115-60 | Alternate EEG amplifier |
| 363/CP PLUG COLLAR, PINS SLEEVE | P1 Technologies | 363SLEEVPIN0NL | For electrode holder |
| Cable, 363-363 5CM – 100CM W/MESH 6TCM | P1 Technologies | 363363XXXXCM004 | mouse-to-commutator cable |
| CCTV cameras Qcwox HD Sony IR LED | Sony | QC-SP316 | |
| Commutator SL6C/SB (single brush) | P1 Technologies | 8BSL6CSBC0MT | formerly Plastics One, Inc. |
| Current amplifier | A-M Systems | Model 2100 | |
| Dental cement | Stoelting | 51459 | |
| Drill bits, #75, OD 0.310" LOC 130 PT | Kyocera | 105-0210.310 | |
| E363/0 SOCKET CONTACT SKEWED | P1 Technologies | 8IE3630XXXXE | pins for connector |
| iBond Self Etch glue | Kulzer | CE0197 | |
| MS363 PEDESTAL 2298 6 PIN WHITE | P1 Technologies | 8K000229801F | EEG headset connector |
| Ohmeter | Simpson | 260 | High sensitivity |
| PowerLab 16/35 and LabChart Pro | AD Instruments | PL3516/P | Alternate EEG software |
| SomnoSuite | Kent Scientific Corp. | SS-01 | anesthesia unit & RightTemp monitoring |
| Stereotactic drill and micromotor kit | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
| Stereotactic frame | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Teflon-coated wire for depth electrode, OD 0.008' | A-M Systems | 791400 | |
| VGAT-Cre mice on congenic C57BL/6J background | The Jackson Laboratory | 000664 |
References
- Lekoubou, A., Bishu, K. G., Ovbiagele, B. Nationwide trends in medical expenditures among adults with epilepsy: 2003-2014. Journal of the Neurological Sciences. 384, 113-120 (2018).
- Hauser, W. A., Hesdorffer, D. C. Epilepsy: Frequency, Causes, and Consequences. Epilepsy Foundation of America. , (1990).
- Galanopoulou, A. S., et al. Identification of new epilepsy treatments: issues in preclinical methodology. Epilepsia. 53 (3), 571-582 (2012).
- Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
- Buckmaster, P. S. Laboratory animal models of temporal lobe epilepsy. Comparative Medicine. 54 (5), 473-485 (2004).
- Levesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 45-52 (2016).
- Loscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 102 (3), 153-159 (2012).
- Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
- Dey, D., et al. A potassium leak channel silences hyperactive neurons and ameliorates status epilepticus. Epilepsia. 55 (2), 203-213 (2014).
- Straub, J., et al. Characterization of kindled VGAT-Cre mice as a new animal model of temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 61 (10), 11 (2020).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412 (2010).
- Vong, L., et al. Leptin action on GABAergic neurons prevents obesity and reduces inhibitory tone to POMC neurons. Neuron. 71 (1), 142-154 (2011).
- Vora, S. R., Camci, E. D., Cox, T. C. Postnatal ontogeny of the cranial base and craniofacial skeleton in male C57BL/6J mice: A reference standard for quantitative analysis. Frontiers in Physiology. 6, (2016).
- Lothman, E. W., Bertram, E. H., Bekenstein, J. W., Perlin, J. B. Self-sustaining limbic status epilepticus induced by ‘continuous’ hippocampal stimulation: electrographic and behavioral characteristics. Epilepsy Research. 3 (2), 107-119 (1989).
- Lothman, E. W., Williamson, J. M. Influence of electrical stimulus parameters on afterdischarge thresholds in the rat hippocampus. Epilepsy Research. 13 (3), 205-213 (1992).
- Lewczuk, E., et al. Electroencephalography and behavior patterns during experimental status epilepticus. Epilepsia. 59 (2), 369-380 (2018).
- Wenker, I. C., et al. Postictal death is associated with tonic phase apnea in a mouse model of sudden unexpected death in epilepsy. Annals of Neurology. 89 (5), 1023-1035 (2021).
- Morimoto, K., Fahnestock, M., Racine, R. J. Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain. Progress in Neurobiology. 73 (1), 1-60 (2004).
