Préparation et implantation d’électrodes pour allumer électriquement des souris VGAT-Cre afin de générer un modèle pour l’épilepsie du lobe temporal
Summary
Ce rapport décrit les méthodes permettant de générer un modèle d’épilepsie du lobe temporal basé sur l’allumage électrique de souris transgéniques VGAT-Cre. Les souris VGAT-Cre allumées peuvent être utiles pour déterminer les causes de l’épilepsie et pour dépister de nouvelles thérapies.
Abstract
Il a été découvert que l’allumage électrique des souris VGAT-Cre a conduit aux crises spontanées motrices et électrographiques. Un article récent s’est concentré sur la façon dont les souris VGAT-Cre uniques ont été utilisées dans le développement de crises spontanées récurrentes (SRS) après l’allumage et un mécanisme probable – l’insertion de Cre dans le gène VGAT – a perturbé son expression et réduit le tonus GABAergique. La présente étude étend ces observations à une plus grande cohorte de souris, en se concentrant sur des questions clés telles que la durée du SRS après l’allumage et l’effet du sexe et de l’âge de l’animal. Ce rapport décrit les protocoles pour les étapes clés suivantes : fabrication de casques avec des électrodes de profondeur hippocampiques pour la stimulation électrique et pour la lecture de l’électroencéphalogramme; chirurgie pour fixer solidement le casque sur le crâne de la souris afin qu’il ne tombe pas; et les détails clés du protocole d’allumage électrique tels que la durée de l’impulsion, la fréquence du train, la durée du train et la quantité de courant injecté. Le protocole d’allumage est robuste en ce sens qu’il conduit de manière fiable à l’épilepsie chez la plupart des souris VGAT-Cre, fournissant un nouveau modèle pour tester de nouveaux médicaments antiépileptogènes.
Introduction
L’épilepsie est un trouble neurologique majeur qui entraîne des charges économiques et humaines importantes. NINDS estime qu’il y a 3 millions d’Américains atteints d’épilepsie. Environ 0,6 million de ces patients souffrent d’épilepsie du lobe temporal (EAL)1. Malheureusement, le traitement médical du TLE échoue chez un tiers des patients en raison de l’inefficacité, du développement d’une résistance aux médicaments ou d’une intolérance aux effets secondaires2. De toute évidence, il existe un besoin important de développer de nouvelles thérapies pour le TLE, une conclusion partagée par le comité scientifique fondamental de l’American Epilepsy Society, le groupe de travail de la Ligue internationale contre l’épilepsie pour la découverte de médicaments précliniques contre l’épilepsie et le National Advisory Neurological Disorders and Stroke Council 3,4.
Les modèles animaux actuels d’épilepsie du lobe temporal utilisent soit des chimioconvulsivants (p. ex. kainate, pilocarpine), soit une stimulation électrique prolongée pour induire un état de mal épileptique de longue durée 5,6,7. De nombreux animaux meurent pendant la procédure (10% à 30% chez le rat, jusqu’à 90% chez la souris8). Les animaux qui survivent et développent l’épilepsie montrent une mort neuronale étendue dans tout le cerveau 9,10. Cette mort déclenche une cascade de réponses, à commencer par l’activation de la microglie, des astrocytes et des monocytes infiltrants. Les réponses neuronales comprennent la réorganisation des circuits (p. ex., germination de fibres moussues), la naissance de nouveaux neurones qui ne s’intègrent pas correctement dans les circuits (p. ex., les cellules granulaires ectopiques) et les changements intrinsèques qui conduisent à l’hyperexcitabilité (p. ex. régulation positive des canaux Na+). Un modèle d’épilepsie sans mort neuronale significative facilitera la recherche de nouveaux médicaments antiépileptiques.
En testant l’hypothèse GABA de l’épilepsie, il a été découvert que le traitement des souris VGAT-Cre avec un protocole d’allumage électrique doux conduisait aux crises spontanées motrices et électrographiques11. En général, l’allumage électrique des rongeurs ne conduit pas à des crises spontanées qui définissent l’épilepsie, bien qu’il le puisse, en cas de surallumage11. Les souris VGAT-Cre expriment la Cre recombinase sous le contrôle du gène du transporteur GABA vésiculaire (VGAT), qui est spécifiquement exprimé dans les neurones inhibiteurs GABAergiques. Il a été constaté que l’insertion de Cre perturbait l’expression de VGAT au niveau de l’ARNm et des protéines, altérant ainsi la transmission synaptique GABAergique dans l’hippocampe. Il a été conclu que les souris allumées VGAT-Cre pourraient être utiles pour étudier les mécanismes impliqués dans l’épileptogenèse et pour le criblage de nouveaux traitements11. Le présent rapport décrit en détail les méthodes utilisées pour générer le modèle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce rapport décrit un protocole où l’allumage électrique de souris conduit à l’épilepsie. Puisque l’électrode stimulante est placée dans l’hippocampe, il s’agit d’une épilepsie limbique focale qui modélise l’épilepsie du lobe temporal (TLE) chez les patients. Une étape critique de ce protocole consiste à utiliser des souris VGAT-Cre qui, en raison de l’insertion d’une cassette de recombinase IRES-Cre dans le gène Vgat , présentent des courants GABA inhibiteurs altérés<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient John Williamson pour ses discussions utiles sur ce protocole. Ce travail a été soutenu par la subvention NS112549 des NIH/NINDS.
Materials
| 16 Channel Extracellular Differential AC Amplifier (115V/60Hz) | AD Instruments | AM3500-115-60 | Alternate EEG amplifier |
| 363/CP PLUG COLLAR, PINS SLEEVE | P1 Technologies | 363SLEEVPIN0NL | For electrode holder |
| Cable, 363-363 5CM – 100CM W/MESH 6TCM | P1 Technologies | 363363XXXXCM004 | mouse-to-commutator cable |
| CCTV cameras Qcwox HD Sony IR LED | Sony | QC-SP316 | |
| Commutator SL6C/SB (single brush) | P1 Technologies | 8BSL6CSBC0MT | formerly Plastics One, Inc. |
| Current amplifier | A-M Systems | Model 2100 | |
| Dental cement | Stoelting | 51459 | |
| Drill bits, #75, OD 0.310" LOC 130 PT | Kyocera | 105-0210.310 | |
| E363/0 SOCKET CONTACT SKEWED | P1 Technologies | 8IE3630XXXXE | pins for connector |
| iBond Self Etch glue | Kulzer | CE0197 | |
| MS363 PEDESTAL 2298 6 PIN WHITE | P1 Technologies | 8K000229801F | EEG headset connector |
| Ohmeter | Simpson | 260 | High sensitivity |
| PowerLab 16/35 and LabChart Pro | AD Instruments | PL3516/P | Alternate EEG software |
| SomnoSuite | Kent Scientific Corp. | SS-01 | anesthesia unit & RightTemp monitoring |
| Stereotactic drill and micromotor kit | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
| Stereotactic frame | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Teflon-coated wire for depth electrode, OD 0.008' | A-M Systems | 791400 | |
| VGAT-Cre mice on congenic C57BL/6J background | The Jackson Laboratory | 000664 |
References
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