Temporal lob epilepsisi için bir model oluşturmak üzere elektriksel olarak çırılan VGAT-Cre fareleri için elektrotların hazırlanması ve implantasyonu
Summary
Bu yazıda, transgenik VGAT-Cre farelerinin elektriksel çıralarına dayanan temporal lob epilepsi modeli oluşturma yöntemleri açıklanmaktadır. Kindled VGAT-Cre fareleri, epilepsiye neyin neden olduğunu belirlemede ve yeni tedavileri taramada yararlı olabilir.
Abstract
VGAT-Cre farelerinin elektriksel çıralarının spontan motor ve elektrografik nöbetlere yol açtığı keşfedildi. Yakın tarihli bir makale, benzersiz VGAT-Cre farelerinin çıralamadan sonra spontan tekrarlayan nöbetler (SRS) geliştirmede nasıl kullanıldığına ve olası bir mekanizmanın – Cre’nin VGAT genine yerleştirilmesi – ekspresyonunu bozdu ve GABAerjik tonu azalttı. Bu çalışma, bu gözlemleri daha büyük bir fare kohortuna genişleterek, SRS’nin çıralamadan sonra ne kadar süre devam ettiği ve hayvanın cinsiyetinin ve yaşının etkisi gibi kilit konulara odaklanmaktadır. Bu raporda aşağıdaki önemli adımlar için protokoller açıklanmaktadır: elektriksel stimülasyon ve elektroensefalogramı okumak için hipokampal derinlik elektrotlarına sahip kulaklıklar yapmak; kulaklığı farenin kafatasına güvenli bir şekilde yapıştırmak için ameliyat, böylece düşmez; ve darbenin süresi, trenin sıklığı, trenin süresi ve enjekte edilen akım miktarı gibi elektrik çıra protokolünün önemli ayrıntıları. Çıra protokolü, çoğu VGAT-Cre faresinde güvenilir bir şekilde epilepsiye yol açması ve yeni antiepileptojenik ilaçları test etmek için yeni bir model sağlaması bakımından sağlamdır.
Introduction
Epilepsi, önemli ekonomik ve beşeri yükleri olan majör bir nörolojik hastalıktır. NINDS, epilepsili 3 milyon Amerikalı olduğunu tahmin ediyor. Bu hastaların yaklaşık 0,6 milyonunda temporal lob epilepsisi (TLE) vardır1. Ne yazık ki, TLE’nin tıbbi tedavisi hastaların üçte birinde etkisizlik, ilaç direnci gelişimi veya yan etkilere karşı toleranssızlık nedeniyle başarısız olmaktadır2. Açıkçası, Amerikan Epilepsi Derneği Temel Bilim Komitesi, Preklinik Epilepsi İlaç Keşfi için Uluslararası Epilepsiye Karşı Birlik Çalışma Grubu ve Ulusal Danışma Nörolojik Bozukluklar ve İnme Konseyi 3,4 tarafından paylaşılan bir sonuç olan TLE için yeni tedaviler geliştirmeye önemli bir ihtiyaç vardır.
Temporal lob epilepsisinin mevcut hayvan modelleri, uzun süreli status epileptikusu indüklemek için kemokonvülzanlar (örneğin, kainat, pilokarpin) veya uzun süreli elektriksel stimülasyon kullanır 5,6,7. İşlem sırasında birçok hayvan ölür (sıçanlarda% 10-30, farelerde% 90’a kadar8). Hayatta kalan ve epilepsi geliştiren hayvanlar, beyin boyunca yaygın nöronal ölüm gösterir 9,10. Bu ölüm, mikroglia, astrositler ve sızan monositlerin aktivasyonu ile başlayan bir dizi yanıtı tetikler. Nöronal yanıtlar arasında devre reorganizasyonu (örneğin, yosunlu lif filizlenmesi), devrelere düzgün bir şekilde entegre olamayan yeni nöronların doğumu (örneğin, ektopik granül hücreleri) ve hipereksitabiliteye yol açan içsel değişiklikler (örneğin, Na + kanallarının yukarı regülasyonu) bulunur. Önemli nöronal ölümü olmayan bir epilepsi modeli, yeni antiepileptik ilaçların araştırılmasını kolaylaştıracaktır.
Epilepsinin GABA hipotezini test ederken, VGAT-Cre farelerinin hafif bir elektriksel çıra protokolü ile tedavi edilmesinin spontan motor ve elektrografik nöbetlere yol açtığı keşfedilmiştir11. Genel olarak, kemirgenlerin elektriksel çıralanması, epilepsiyi tanımlayan spontan nöbetlere yol açmaz, ancak aşırı çıra11 vakalarında olabilir. VGAT-Cre fareleri, özellikle GABAerjik inhibitör nöronlarda eksprese edilen veziküler GABA taşıyıcı (VGAT) geninin kontrolü altında Cre rekombinazını eksprese eder. Cre yerleştirilmesinin mRNA ve protein seviyelerinde VGAT ekspresyonunu bozduğu, böylece hipokampusta GABAerjik sinaptik iletimi bozduğu bulundu. Yakılmış VGAT-Cre farelerinin epileptogenezde rol oynayan mekanizmaları incelemek ve yeni terapötikleri taramak için yararlı olabileceği sonucuna varılmıştır11. Bu rapor, modelin oluşturulmasında kullanılan yöntemleri ayrıntılı olarak sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu raporda, farelerin elektriksel çıralarının epilepsiye yol açtığı bir protokol açıklanmaktadır. Uyarıcı elektrot hipokampusa yerleştirildiğinden, bu hastalarda temporal lob epilepsisini (TLE) modelleyen fokal limbik bir epilepsidir. Bu protokoldeki kritik bir adım, Vgat genine bir IRES-Cre rekombinaz kasetinin yerleştirilmesi nedeniyle, bozulmuş inhibitör GABA akımları11’i gösteren VGAT-Cre farelerini kullanmaktır. C57BL / 6, bu protokolle tutuşturulduktan sonra …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu protokol hakkındaki yararlı tartışmalar için John Williamson’a teşekkür eder. Bu çalışma NIH / NINDS hibesi NS112549 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 16 Channel Extracellular Differential AC Amplifier (115V/60Hz) | AD Instruments | AM3500-115-60 | Alternate EEG amplifier |
| 363/CP PLUG COLLAR, PINS SLEEVE | P1 Technologies | 363SLEEVPIN0NL | For electrode holder |
| Cable, 363-363 5CM – 100CM W/MESH 6TCM | P1 Technologies | 363363XXXXCM004 | mouse-to-commutator cable |
| CCTV cameras Qcwox HD Sony IR LED | Sony | QC-SP316 | |
| Commutator SL6C/SB (single brush) | P1 Technologies | 8BSL6CSBC0MT | formerly Plastics One, Inc. |
| Current amplifier | A-M Systems | Model 2100 | |
| Dental cement | Stoelting | 51459 | |
| Drill bits, #75, OD 0.310" LOC 130 PT | Kyocera | 105-0210.310 | |
| E363/0 SOCKET CONTACT SKEWED | P1 Technologies | 8IE3630XXXXE | pins for connector |
| iBond Self Etch glue | Kulzer | CE0197 | |
| MS363 PEDESTAL 2298 6 PIN WHITE | P1 Technologies | 8K000229801F | EEG headset connector |
| Ohmeter | Simpson | 260 | High sensitivity |
| PowerLab 16/35 and LabChart Pro | AD Instruments | PL3516/P | Alternate EEG software |
| SomnoSuite | Kent Scientific Corp. | SS-01 | anesthesia unit & RightTemp monitoring |
| Stereotactic drill and micromotor kit | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
| Stereotactic frame | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Teflon-coated wire for depth electrode, OD 0.008' | A-M Systems | 791400 | |
| VGAT-Cre mice on congenic C57BL/6J background | The Jackson Laboratory | 000664 |
References
- Lekoubou, A., Bishu, K. G., Ovbiagele, B. Nationwide trends in medical expenditures among adults with epilepsy: 2003-2014. Journal of the Neurological Sciences. 384, 113-120 (2018).
- Hauser, W. A., Hesdorffer, D. C. Epilepsy: Frequency, Causes, and Consequences. Epilepsy Foundation of America. , (1990).
- Galanopoulou, A. S., et al. Identification of new epilepsy treatments: issues in preclinical methodology. Epilepsia. 53 (3), 571-582 (2012).
- Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
- Buckmaster, P. S. Laboratory animal models of temporal lobe epilepsy. Comparative Medicine. 54 (5), 473-485 (2004).
- Levesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 45-52 (2016).
- Loscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 102 (3), 153-159 (2012).
- Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
- Dey, D., et al. A potassium leak channel silences hyperactive neurons and ameliorates status epilepticus. Epilepsia. 55 (2), 203-213 (2014).
- Straub, J., et al. Characterization of kindled VGAT-Cre mice as a new animal model of temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 61 (10), 11 (2020).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412 (2010).
- Vong, L., et al. Leptin action on GABAergic neurons prevents obesity and reduces inhibitory tone to POMC neurons. Neuron. 71 (1), 142-154 (2011).
- Vora, S. R., Camci, E. D., Cox, T. C. Postnatal ontogeny of the cranial base and craniofacial skeleton in male C57BL/6J mice: A reference standard for quantitative analysis. Frontiers in Physiology. 6, (2016).
- Lothman, E. W., Bertram, E. H., Bekenstein, J. W., Perlin, J. B. Self-sustaining limbic status epilepticus induced by ‘continuous’ hippocampal stimulation: electrographic and behavioral characteristics. Epilepsy Research. 3 (2), 107-119 (1989).
- Lothman, E. W., Williamson, J. M. Influence of electrical stimulus parameters on afterdischarge thresholds in the rat hippocampus. Epilepsy Research. 13 (3), 205-213 (1992).
- Lewczuk, E., et al. Electroencephalography and behavior patterns during experimental status epilepticus. Epilepsia. 59 (2), 369-380 (2018).
- Wenker, I. C., et al. Postictal death is associated with tonic phase apnea in a mouse model of sudden unexpected death in epilepsy. Annals of Neurology. 89 (5), 1023-1035 (2021).
- Morimoto, K., Fahnestock, M., Racine, R. J. Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain. Progress in Neurobiology. 73 (1), 1-60 (2004).
