Подготовка и имплантация электродов для электрического разжигания мышей VGAT-Cre для создания модели височной эпилепсии
Summary
В этом отчете описаны методы создания модели височной эпилепсии на основе электрического растопления трансгенных мышей VGAT-Cre. Разожженные мыши VGAT-Cre могут быть полезны для определения причин эпилепсии и для скрининга новых методов лечения.
Abstract
Было обнаружено, что электрическое растопление мышей VGAT-Cre приводило к спонтанным двигательным и электрографическим припадкам. Недавняя статья была посвящена тому, как уникальные мыши VGAT-Cre использовались для развития спонтанных повторяющихся припадков (SRS) после разжигания, и вероятный механизм – вставка Cre в ген VGAT – нарушил его экспрессию и снизил ГАМКергический тонус. Настоящее исследование распространяет эти наблюдения на большую когорту мышей, уделяя особое внимание ключевым вопросам, таким как продолжительность SRS после растопки и влияние пола и возраста животного. В этом отчете описываются протоколы для следующих ключевых этапов: изготовление гарнитур с глубинными электродами гиппокампа для электростимуляции и считывания электроэнцефалограммы; операция по надежному закреплению гарнитуры на черепе мыши, чтобы она не отваливалась; и ключевые детали протокола электрического разжигания, такие как продолжительность импульса, частота поезда, продолжительность поезда и величина вводимого тока. Протокол растопки надежен тем, что он надежно приводит к эпилепсии у большинства мышей VGAT-Cre, предоставляя новую модель для тестирования новых противоэпилептогенных препаратов.
Introduction
Эпилепсия является серьезным неврологическим расстройством со значительным экономическим и человеческим бременем. По оценкам NINDS, в мире насчитывается 3 миллиона американцев, страдающих эпилепсией. Примерно 0,6 миллиона из этих пациентов страдают височной эпилепсией (TLE)1. К сожалению, медикаментозное лечение TLE терпит неудачу у одной трети пациентов из-за неэффективности, развития лекарственной устойчивости или непереносимости побочных эффектов2. Очевидно, что существует значительная потребность в разработке новых методов лечения TLE, и этот вывод разделяют Комитет по фундаментальным наукам Американского общества эпилепсии, Рабочая группа Международной лиги по борьбе с эпилепсией по открытию доклинических лекарств от эпилепсии и Национальный консультативный совет по неврологическим расстройствам и инсульту 3,4.
Современные модели височной эпилепсии на животных используют либо химоконсудорожные препараты (например, каинат, пилокарпин), либо длительную электрическую стимуляцию, чтобы вызвать длительный эпилептический статус 5,6,7. Многие животные умирают во время процедуры (10-30% у крыс, до 90% у мышей8). Животные, которые выживают и развивают эпилепсию, демонстрируют обширную гибель нейронов по всему мозгу 9,10. Эта смерть вызывает каскад реакций, начиная с активации микроглии, астроцитов и проникающих моноцитов. Нейронные реакции включают реорганизацию цепей (например, прорастание мшистых волокон), рождение новых нейронов, которые не могут должным образом интегрироваться в цепи (например, эктопические гранулярные клетки), и внутренние изменения, которые приводят к гипервозбудимости (например, активация каналов Na+). Модель эпилепсии без значительной гибели нейронов облегчит поиск новых противоэпилептических препаратов.
При проверке ГАМК-гипотезы эпилепсии было обнаружено, что лечение мышей VGAT-Cre мягким протоколом электрического разжигания приводило к спонтанным моторным и электрографическим припадкам11. В целом, электрическая растопка грызунов не приводит к спонтанным припадкам, определяющим эпилепсию, хотя может, в случаях чрезмерного разжигания11. Мыши VGAT-Cre экспрессируют рекомбиназу Cre под контролем гена везикулярного переносчика ГАМК (VGAT), который специфически экспрессируется в ГАМКергических тормозных нейронах. Было обнаружено, что вставка Cre нарушает экспрессию VGAT на уровне мРНК и белка, тем самым ухудшая ГАМКергическую синаптическую передачу в гиппокампе. Был сделан вывод, что разожженные мыши VGAT-Cre могут быть полезны для изучения механизмов, участвующих в эпилептогенезе, и для скрининга новых терапевтических средств11. В настоящем докладе подробно описываются методы, использованные при создании модели.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом отчете описывается протокол, в котором электрическое разжигание мышей приводит к эпилепсии. Поскольку стимулирующий электрод помещается в гиппокамп, это фокальная лимбическая эпилепсия, которая моделирует височную эпилепсию (TLE) у пациентов. Критическим шагом в этом протоколе ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Джона Уильямсона за полезное обсуждение этого протокола. Эта работа была поддержана грантом NIH/NINDS NS112549.
Materials
| 16 Channel Extracellular Differential AC Amplifier (115V/60Hz) | AD Instruments | AM3500-115-60 | Alternate EEG amplifier |
| 363/CP PLUG COLLAR, PINS SLEEVE | P1 Technologies | 363SLEEVPIN0NL | For electrode holder |
| Cable, 363-363 5CM – 100CM W/MESH 6TCM | P1 Technologies | 363363XXXXCM004 | mouse-to-commutator cable |
| CCTV cameras Qcwox HD Sony IR LED | Sony | QC-SP316 | |
| Commutator SL6C/SB (single brush) | P1 Technologies | 8BSL6CSBC0MT | formerly Plastics One, Inc. |
| Current amplifier | A-M Systems | Model 2100 | |
| Dental cement | Stoelting | 51459 | |
| Drill bits, #75, OD 0.310" LOC 130 PT | Kyocera | 105-0210.310 | |
| E363/0 SOCKET CONTACT SKEWED | P1 Technologies | 8IE3630XXXXE | pins for connector |
| iBond Self Etch glue | Kulzer | CE0197 | |
| MS363 PEDESTAL 2298 6 PIN WHITE | P1 Technologies | 8K000229801F | EEG headset connector |
| Ohmeter | Simpson | 260 | High sensitivity |
| PowerLab 16/35 and LabChart Pro | AD Instruments | PL3516/P | Alternate EEG software |
| SomnoSuite | Kent Scientific Corp. | SS-01 | anesthesia unit & RightTemp monitoring |
| Stereotactic drill and micromotor kit | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
| Stereotactic frame | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Teflon-coated wire for depth electrode, OD 0.008' | A-M Systems | 791400 | |
| VGAT-Cre mice on congenic C57BL/6J background | The Jackson Laboratory | 000664 |
References
- Lekoubou, A., Bishu, K. G., Ovbiagele, B. Nationwide trends in medical expenditures among adults with epilepsy: 2003-2014. Journal of the Neurological Sciences. 384, 113-120 (2018).
- Hauser, W. A., Hesdorffer, D. C. Epilepsy: Frequency, Causes, and Consequences. Epilepsy Foundation of America. , (1990).
- Galanopoulou, A. S., et al. Identification of new epilepsy treatments: issues in preclinical methodology. Epilepsia. 53 (3), 571-582 (2012).
- Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
- Buckmaster, P. S. Laboratory animal models of temporal lobe epilepsy. Comparative Medicine. 54 (5), 473-485 (2004).
- Levesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 45-52 (2016).
- Loscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 102 (3), 153-159 (2012).
- Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
- Dey, D., et al. A potassium leak channel silences hyperactive neurons and ameliorates status epilepticus. Epilepsia. 55 (2), 203-213 (2014).
- Straub, J., et al. Characterization of kindled VGAT-Cre mice as a new animal model of temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 61 (10), 11 (2020).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412 (2010).
- Vong, L., et al. Leptin action on GABAergic neurons prevents obesity and reduces inhibitory tone to POMC neurons. Neuron. 71 (1), 142-154 (2011).
- Vora, S. R., Camci, E. D., Cox, T. C. Postnatal ontogeny of the cranial base and craniofacial skeleton in male C57BL/6J mice: A reference standard for quantitative analysis. Frontiers in Physiology. 6, (2016).
- Lothman, E. W., Bertram, E. H., Bekenstein, J. W., Perlin, J. B. Self-sustaining limbic status epilepticus induced by ‘continuous’ hippocampal stimulation: electrographic and behavioral characteristics. Epilepsy Research. 3 (2), 107-119 (1989).
- Lothman, E. W., Williamson, J. M. Influence of electrical stimulus parameters on afterdischarge thresholds in the rat hippocampus. Epilepsy Research. 13 (3), 205-213 (1992).
- Lewczuk, E., et al. Electroencephalography and behavior patterns during experimental status epilepticus. Epilepsia. 59 (2), 369-380 (2018).
- Wenker, I. C., et al. Postictal death is associated with tonic phase apnea in a mouse model of sudden unexpected death in epilepsy. Annals of Neurology. 89 (5), 1023-1035 (2021).
- Morimoto, K., Fahnestock, M., Racine, R. J. Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain. Progress in Neurobiology. 73 (1), 1-60 (2004).
