Preparazione e impianto di elettrodi per l'accensione elettrica di topi VGAT-Cre per generare un modello per l'epilessia del lobo temporale
Summary
Questo rapporto descrive i metodi per generare un modello di epilessia del lobo temporale basato sull’accensione elettrica di topi transgenici VGAT-Cre. I topi Kindled VGAT-Cre possono essere utili per determinare ciò che causa l’epilessia e per lo screening di nuove terapie.
Abstract
È stato scoperto che l’accensione elettrica dei topi VGAT-Cre ha portato alle crisi motorie ed elettrografiche spontanee. Un recente articolo si è concentrato su come i topi VGAT-Cre unici sono stati utilizzati nello sviluppo di crisi ricorrenti spontanee (SRS) dopo l’accensione e un probabile meccanismo – l’inserimento di Cre nel gene VGAT – ha interrotto la sua espressione e ridotto il tono GABAergico. Il presente studio estende queste osservazioni a una coorte più ampia di topi, concentrandosi su questioni chiave come per quanto tempo l’SRS continua dopo l’accensione e l’effetto del sesso e dell’età dell’animale. Questo rapporto descrive i protocolli per i seguenti passaggi chiave: realizzazione di cuffie con elettrodi di profondità ippocampali per la stimolazione elettrica e per la lettura dell’elettroencefalogramma; intervento chirurgico per fissare saldamente l’auricolare sul cranio del topo in modo che non cada; e dettagli chiave del protocollo di accensione elettrica come la durata dell’impulso, la frequenza del treno, la durata del treno e la quantità di corrente iniettata. Il protocollo di accensione è robusto in quanto porta in modo affidabile all’epilessia nella maggior parte dei topi VGAT-Cre, fornendo un nuovo modello per testare nuovi farmaci antiepilettogeni.
Introduction
L’epilessia è un grave disturbo neurologico con significativi oneri economici e umani. NINDS stima che ci siano 3 milioni di americani con epilessia. Circa 0,6 milioni di questi pazienti sono affetti da epilessia del lobo temporale (TLE)1. Sfortunatamente, il trattamento medico del TLE fallisce in un terzo dei pazienti a causa dell’inefficacia, dello sviluppo di resistenza ai farmaci o dell’intolleranza agli effetti collaterali2. Chiaramente, c’è una significativa necessità di sviluppare nuove terapie per TLE, una conclusione condivisa dall’American Epilepsy Society Basic Science Committee, dall’International League Against Epilepsy Working Group for Preclinical Epilepsy Drug Discovery e dal National Advisory Neurological Disorders and Stroke Council 3,4.
Gli attuali modelli animali di epilessia del lobo temporale utilizzano chemioconvulsivanti (ad esempio, kainato, pilocarpina) o stimolazione elettrica prolungata per indurre uno stato epilettico di lunga durata 5,6,7. Molti animali muoiono durante la procedura (10% -30% nei ratti, fino al 90% nei topi8). Gli animali che sopravvivono e sviluppano l’epilessia mostrano una morte neuronale estesa in tutto il cervello 9,10. Questa morte innesca una cascata di risposte, a partire dall’attivazione di microglia, astrociti e monociti infiltranti. Le risposte neuronali includono la riorganizzazione dei circuiti (ad esempio, la germinazione delle fibre muschiose), la nascita di nuovi neuroni che non riescono a integrarsi correttamente nei circuiti (ad esempio, cellule granulari ectopiche) e cambiamenti intrinseci che portano all’ipereccitabilità (ad esempio, sovraregolazione dei canali Na+). Un modello di epilessia senza morte neuronale significativa faciliterà la ricerca di nuovi farmaci antiepilettici.
Durante il test dell’ipotesi GABA dell’epilessia, è stato scoperto che il trattamento dei topi VGAT-Cre con un lieve protocollo di accensione elettrica ha portato alle crisi motorie ed elettrografiche spontanee11. In generale, l’accensione elettrica dei roditori non porta a convulsioni spontanee che definiscono l’epilessia, sebbene possa, in caso di eccesso di accensione11. I topi VGAT-Cre esprimono Cre ricombinasi sotto il controllo del gene trasportatore vescicolare GABA (VGAT), che è specificamente espresso nei neuroni inibitori GABAergici. È stato riscontrato che l’inserimento di Cre ha interrotto l’espressione di VGAT a livello di mRNA e proteine, compromettendo così la trasmissione sinaptica GABAergica nell’ippocampo. Si è concluso che i topi VGAT-Cre accesi potrebbero essere utili per studiare i meccanismi coinvolti nell’epilettogenesi e per lo screening di nuove terapie11. Il presente rapporto fornisce in dettaglio i metodi utilizzati per generare il modello.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo rapporto descrive un protocollo in cui l’accensione elettrica dei topi porta all’epilessia. Poiché l’elettrodo stimolante è posizionato nell’ippocampo, questa è un’epilessia limbica focale che modella l’epilessia del lobo temporale (TLE) nei pazienti. Un passo fondamentale in questo protocollo è quello di utilizzare topi VGAT-Cre, che a causa dell’inserimento di una cassetta di ricombinasi IRES-Cre nel gene Vgat , mostra alterate correnti inibitorie GABA11. C57BL / 6 non svilup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano John Williamson per le utili discussioni su questo protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH/NINDS NS112549.
Materials
| 16 Channel Extracellular Differential AC Amplifier (115V/60Hz) | AD Instruments | AM3500-115-60 | Alternate EEG amplifier |
| 363/CP PLUG COLLAR, PINS SLEEVE | P1 Technologies | 363SLEEVPIN0NL | For electrode holder |
| Cable, 363-363 5CM – 100CM W/MESH 6TCM | P1 Technologies | 363363XXXXCM004 | mouse-to-commutator cable |
| CCTV cameras Qcwox HD Sony IR LED | Sony | QC-SP316 | |
| Commutator SL6C/SB (single brush) | P1 Technologies | 8BSL6CSBC0MT | formerly Plastics One, Inc. |
| Current amplifier | A-M Systems | Model 2100 | |
| Dental cement | Stoelting | 51459 | |
| Drill bits, #75, OD 0.310" LOC 130 PT | Kyocera | 105-0210.310 | |
| E363/0 SOCKET CONTACT SKEWED | P1 Technologies | 8IE3630XXXXE | pins for connector |
| iBond Self Etch glue | Kulzer | CE0197 | |
| MS363 PEDESTAL 2298 6 PIN WHITE | P1 Technologies | 8K000229801F | EEG headset connector |
| Ohmeter | Simpson | 260 | High sensitivity |
| PowerLab 16/35 and LabChart Pro | AD Instruments | PL3516/P | Alternate EEG software |
| SomnoSuite | Kent Scientific Corp. | SS-01 | anesthesia unit & RightTemp monitoring |
| Stereotactic drill and micromotor kit | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
| Stereotactic frame | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Teflon-coated wire for depth electrode, OD 0.008' | A-M Systems | 791400 | |
| VGAT-Cre mice on congenic C57BL/6J background | The Jackson Laboratory | 000664 |
References
- Lekoubou, A., Bishu, K. G., Ovbiagele, B. Nationwide trends in medical expenditures among adults with epilepsy: 2003-2014. Journal of the Neurological Sciences. 384, 113-120 (2018).
- Hauser, W. A., Hesdorffer, D. C. Epilepsy: Frequency, Causes, and Consequences. Epilepsy Foundation of America. , (1990).
- Galanopoulou, A. S., et al. Identification of new epilepsy treatments: issues in preclinical methodology. Epilepsia. 53 (3), 571-582 (2012).
- Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
- Buckmaster, P. S. Laboratory animal models of temporal lobe epilepsy. Comparative Medicine. 54 (5), 473-485 (2004).
- Levesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 45-52 (2016).
- Loscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 102 (3), 153-159 (2012).
- Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
- Dey, D., et al. A potassium leak channel silences hyperactive neurons and ameliorates status epilepticus. Epilepsia. 55 (2), 203-213 (2014).
- Straub, J., et al. Characterization of kindled VGAT-Cre mice as a new animal model of temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 61 (10), 11 (2020).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412 (2010).
- Vong, L., et al. Leptin action on GABAergic neurons prevents obesity and reduces inhibitory tone to POMC neurons. Neuron. 71 (1), 142-154 (2011).
- Vora, S. R., Camci, E. D., Cox, T. C. Postnatal ontogeny of the cranial base and craniofacial skeleton in male C57BL/6J mice: A reference standard for quantitative analysis. Frontiers in Physiology. 6, (2016).
- Lothman, E. W., Bertram, E. H., Bekenstein, J. W., Perlin, J. B. Self-sustaining limbic status epilepticus induced by ‘continuous’ hippocampal stimulation: electrographic and behavioral characteristics. Epilepsy Research. 3 (2), 107-119 (1989).
- Lothman, E. W., Williamson, J. M. Influence of electrical stimulus parameters on afterdischarge thresholds in the rat hippocampus. Epilepsy Research. 13 (3), 205-213 (1992).
- Lewczuk, E., et al. Electroencephalography and behavior patterns during experimental status epilepticus. Epilepsia. 59 (2), 369-380 (2018).
- Wenker, I. C., et al. Postictal death is associated with tonic phase apnea in a mouse model of sudden unexpected death in epilepsy. Annals of Neurology. 89 (5), 1023-1035 (2021).
- Morimoto, K., Fahnestock, M., Racine, R. J. Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain. Progress in Neurobiology. 73 (1), 1-60 (2004).
