Voorbereiding en implantatie van elektroden voor elektrisch aanmaakhout VGAT-Cre muizen om een model voor temporale kwab epilepsie te genereren
Summary
Dit rapport beschrijft de methoden om een model van temporale kwab epilepsie te genereren op basis van de elektrische aanmaakhoutjes van transgene VGAT-Cre muizen. Ontstoken VGAT-Cre-muizen kunnen nuttig zijn bij het bepalen van de oorzaak van epilepsie en voor het screenen van nieuwe therapieën.
Abstract
Er werd ontdekt dat elektrische aanmaakhoutjes van VGAT-Cre-muizen leidden tot de spontane motorische en elektrografische aanvallen. Een recent artikel richtte zich op hoe unieke VGAT-Cre-muizen werden gebruikt bij het ontwikkelen van spontane terugkerende aanvallen (SRS) na aanmaakhout en een waarschijnlijk mechanisme – het inbrengen van Cre in het VGAT-gen – verstoorde de expressie ervan en verminderde de GABAerge toon. De huidige studie breidt deze observaties uit naar een groter cohort muizen, met de nadruk op belangrijke kwesties zoals hoe lang de SRS doorgaat na aanmaakhout en het effect van het geslacht en de leeftijd van het dier. Dit rapport beschrijft de protocollen voor de volgende belangrijke stappen: het maken van headsets met hippocampale diepte-elektroden voor elektrische stimulatie en voor het lezen van het elektro-encefalogram; operatie om de headset stevig op de schedel van de muis te bevestigen, zodat deze er niet af valt; en belangrijke details van het elektrische aanmaakblokprotocol, zoals de duur van de puls, de frequentie van de trein, de duur van de trein en de hoeveelheid geïnjecteerde stroom. Het aanmaakhoutprotocol is robuust omdat het betrouwbaar leidt tot epilepsie bij de meeste VGAT-Cre-muizen, wat een nieuw model biedt om te testen op nieuwe anti-epileptogene geneesmiddelen.
Introduction
Epilepsie is een belangrijke neurologische aandoening met aanzienlijke economische en menselijke lasten. NINDS schat dat er 3 miljoen Amerikanen met epilepsie zijn. Ongeveer 0,6 miljoen van deze patiënten hebben temporale kwab epilepsie (TLE)1. Helaas faalt de medische behandeling van TLE bij een derde van de patiënten vanwege ineffectiviteit, ontwikkeling van geneesmiddelresistentie of intolerantie voor bijwerkingen2. Het is duidelijk dat er een aanzienlijke behoefte is aan het ontwikkelen van nieuwe therapieën voor TLE, een conclusie die wordt gedeeld door de American Epilepsy Society Basic Science Committee, de International League Against Epilepsy Working Group for Preclinical Epilepsy Drug Discovery en de National Advisory Neurological Disorders and Stroke Council 3,4.
Huidige diermodellen van temporale kwab epilepsie gebruiken chemoconvulsiva (bijv. kaïnaat, pilocarpine) of langdurige elektrische stimulatie om een langdurige status epilepticus 5,6,7 te induceren. Veel dieren sterven tijdens de procedure (10% -30% bij ratten, tot 90% bij muizen8). Dieren die overleven en epilepsie ontwikkelen, vertonen uitgebreide neuronale dood in de hersenen 9,10. Deze dood veroorzaakt een cascade van reacties, te beginnen met de activering van microglia, astrocyten en infiltrerende monocyten. Neuronale reacties omvatten circuitreorganisatie (bijv. Mossy fiber sprouting), geboorte van nieuwe neuronen die niet goed integreren in circuits (bijv. Ectopische korrelcellen) en intrinsieke veranderingen die leiden tot hyperexcitabiliteit (bijv. Upregulatie van Na + -kanalen). Een epilepsiemodel zonder significante neuronale dood zal de zoektocht naar nieuwe anti-epileptica vergemakkelijken.
Tijdens het testen van de GABA-hypothese van epilepsie, werd ontdekt dat de behandeling van VGAT-Cre-muizen met een mild elektrisch aanmaakblokprotocol leidde tot de spontane motorische en elektrografische aanvallen11. Over het algemeen leidt het elektrische aanmaakhout van knaagdieren niet tot spontane aanvallen die epilepsie definiëren, hoewel het dat wel kan, in gevallen van over-aanmaakhout11. VGAT-Cre muizen brengen Cre recombinase tot expressie onder controle van het vesiculaire GABA transporter (VGAT) gen, dat specifiek tot expressie komt in GABAerge remmende neuronen. Het bleek dat het inbrengen van Cre de expressie van VGAT op mRNA- en eiwitniveaus verstoorde, waardoor GABAerge synaptische transmissie in de hippocampus werd aangetast. Er werd geconcludeerd dat ontstoken VGAT-Cre-muizen nuttig zouden kunnen zijn om de mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij epileptogenese en voor het screenen van nieuwe therapieën11. Dit rapport bevat de methoden die zijn gebruikt om het model in detail te genereren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit rapport beschrijft een protocol waarbij elektrisch aanmaakhout van muizen leidt tot epilepsie. Omdat de stimulerende elektrode in de hippocampus wordt geplaatst, is dit een focale limbische epilepsie die temporale kwab epilepsie (TLE) bij patiënten modelleert. Een cruciale stap in dit protocol is het gebruik van VGAT-Cre-muizen, die als gevolg van het inbrengen van een IRES-Cre-recombinasecassette in het Vgat-gen verminderde remmende GABA-stromen vertonen11. C57BL/6 ontwikkelen geen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken John Williamson voor de nuttige discussies over dit protocol. Dit werk werd ondersteund door NIH/NINDS subsidie NS112549.
Materials
| 16 Channel Extracellular Differential AC Amplifier (115V/60Hz) | AD Instruments | AM3500-115-60 | Alternate EEG amplifier |
| 363/CP PLUG COLLAR, PINS SLEEVE | P1 Technologies | 363SLEEVPIN0NL | For electrode holder |
| Cable, 363-363 5CM – 100CM W/MESH 6TCM | P1 Technologies | 363363XXXXCM004 | mouse-to-commutator cable |
| CCTV cameras Qcwox HD Sony IR LED | Sony | QC-SP316 | |
| Commutator SL6C/SB (single brush) | P1 Technologies | 8BSL6CSBC0MT | formerly Plastics One, Inc. |
| Current amplifier | A-M Systems | Model 2100 | |
| Dental cement | Stoelting | 51459 | |
| Drill bits, #75, OD 0.310" LOC 130 PT | Kyocera | 105-0210.310 | |
| E363/0 SOCKET CONTACT SKEWED | P1 Technologies | 8IE3630XXXXE | pins for connector |
| iBond Self Etch glue | Kulzer | CE0197 | |
| MS363 PEDESTAL 2298 6 PIN WHITE | P1 Technologies | 8K000229801F | EEG headset connector |
| Ohmeter | Simpson | 260 | High sensitivity |
| PowerLab 16/35 and LabChart Pro | AD Instruments | PL3516/P | Alternate EEG software |
| SomnoSuite | Kent Scientific Corp. | SS-01 | anesthesia unit & RightTemp monitoring |
| Stereotactic drill and micromotor kit | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
| Stereotactic frame | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Teflon-coated wire for depth electrode, OD 0.008' | A-M Systems | 791400 | |
| VGAT-Cre mice on congenic C57BL/6J background | The Jackson Laboratory | 000664 |
References
- Lekoubou, A., Bishu, K. G., Ovbiagele, B. Nationwide trends in medical expenditures among adults with epilepsy: 2003-2014. Journal of the Neurological Sciences. 384, 113-120 (2018).
- Hauser, W. A., Hesdorffer, D. C. Epilepsy: Frequency, Causes, and Consequences. Epilepsy Foundation of America. , (1990).
- Galanopoulou, A. S., et al. Identification of new epilepsy treatments: issues in preclinical methodology. Epilepsia. 53 (3), 571-582 (2012).
- Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
- Buckmaster, P. S. Laboratory animal models of temporal lobe epilepsy. Comparative Medicine. 54 (5), 473-485 (2004).
- Levesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 45-52 (2016).
- Loscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 102 (3), 153-159 (2012).
- Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
- Dey, D., et al. A potassium leak channel silences hyperactive neurons and ameliorates status epilepticus. Epilepsia. 55 (2), 203-213 (2014).
- Straub, J., et al. Characterization of kindled VGAT-Cre mice as a new animal model of temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 61 (10), 11 (2020).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412 (2010).
- Vong, L., et al. Leptin action on GABAergic neurons prevents obesity and reduces inhibitory tone to POMC neurons. Neuron. 71 (1), 142-154 (2011).
- Vora, S. R., Camci, E. D., Cox, T. C. Postnatal ontogeny of the cranial base and craniofacial skeleton in male C57BL/6J mice: A reference standard for quantitative analysis. Frontiers in Physiology. 6, (2016).
- Lothman, E. W., Bertram, E. H., Bekenstein, J. W., Perlin, J. B. Self-sustaining limbic status epilepticus induced by ‘continuous’ hippocampal stimulation: electrographic and behavioral characteristics. Epilepsy Research. 3 (2), 107-119 (1989).
- Lothman, E. W., Williamson, J. M. Influence of electrical stimulus parameters on afterdischarge thresholds in the rat hippocampus. Epilepsy Research. 13 (3), 205-213 (1992).
- Lewczuk, E., et al. Electroencephalography and behavior patterns during experimental status epilepticus. Epilepsia. 59 (2), 369-380 (2018).
- Wenker, I. C., et al. Postictal death is associated with tonic phase apnea in a mouse model of sudden unexpected death in epilepsy. Annals of Neurology. 89 (5), 1023-1035 (2021).
- Morimoto, K., Fahnestock, M., Racine, R. J. Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain. Progress in Neurobiology. 73 (1), 1-60 (2004).
