تحضير وزرع أقطاب كهربائية لفئران VGAT-cre المشتعلة كهربائيا لتوليد نموذج لصرع الفص الصدغي
Summary
يصف هذا التقرير طرق توليد نموذج لصرع الفص الصدغي بناء على الإشعال الكهربائي للفئران المعدلة وراثيا VGAT-Cre. قد تكون فئران VGAT-Cre المشابهة مفيدة في تحديد أسباب الصرع وفحص العلاجات الجديدة.
Abstract
تم اكتشاف أن إشعال كهربائي لفئران VGAT-Cre أدى إلى نوبات تلقائية وإلكتروغرافية. ركزت ورقة بحثية حديثة على كيفية استخدام فئران VGAT-Cre الفريدة في تطوير نوبات متكررة عفوية (SRS) بعد إشعال النار وآلية محتملة – إدخال Cre في جين VGAT – عطلت تعبيرها وقللت من نغمة GABAergic. توسع الدراسة الحالية هذه الملاحظات لتشمل مجموعة أكبر من الفئران ، مع التركيز على القضايا الرئيسية مثل المدة التي يستمر فيها SRS بعد إشعال النار وتأثير جنس الحيوان وعمره. يصف هذا التقرير البروتوكولات الخاصة بالخطوات الرئيسية التالية: صنع سماعات رأس مزودة بأقطاب عمق الحصين للتحفيز الكهربائي ولقراءة مخطط كهربية الدماغ. عملية جراحية لتثبيت سماعة الرأس بشكل آمن على جمجمة الماوس حتى لا تسقط ؛ والتفاصيل الرئيسية لبروتوكول إشعال النار الكهربائي مثل مدة النبضة وتردد القطار ومدة القطار وكمية التيار المحقون. بروتوكول إشعال النار قوي من حيث أنه يؤدي بشكل موثوق إلى الصرع في معظم الفئران VGAT-Cre ، مما يوفر نموذجا جديدا لاختبار الأدوية الجديدة المضادة للصرع.
Introduction
الصرع هو اضطراب عصبي كبير مع أعباء اقتصادية وبشرية كبيرة. تقدر NINDS أن هناك 3 ملايين أمريكي يعانون من الصرع. يعاني ما يقرب من 0.6 مليون من هؤلاء المرضى من صرع الفص الصدغي (TLE)1. لسوء الحظ ، فشل العلاج الطبي ل TLE في ثلث المرضى بسبب عدم الفعالية أو تطور مقاومة الأدوية أو عدم تحمل الآثار الجانبية2. من الواضح أن هناك حاجة كبيرة لتطوير علاجات جديدة ل TLE، وهو استنتاج تشاركه لجنة العلوم الأساسية لجمعية الصرع الأمريكية، ومجموعة عمل الرابطة الدولية لمكافحة الصرع لاكتشاف أدوية الصرع قبل السريرية، والمجلس الاستشاري الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية3،4.
تستخدم النماذج الحيوانية الحالية لصرع الفص الصدغي إما الاختلاجات الكيميائية (على سبيل المثال ، kainate ، pilocarpine) أو التحفيز الكهربائي لفترات طويلة للحث على حالة صرع طويلة الأمد5،6،7. تموت العديد من الحيوانات أثناء العملية (10٪ -30٪ في الفئران ، حتى 90٪ في الفئران8). الحيوانات التي تنجو وتطور الصرع تظهر موتا عصبيا واسع النطاق في جميع أنحاء الدماغ 9,10. يؤدي هذا الموت إلى سلسلة من الاستجابات ، بدءا من تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية والخلايا الوحيدة المتسللة. تشمل الاستجابات العصبية إعادة تنظيم الدوائر (على سبيل المثال ، تنبت الألياف الطحلبية) ، ولادة خلايا عصبية جديدة تفشل في الاندماج بشكل صحيح في الدوائر (على سبيل المثال ، الخلايا الحبيبية خارج الرحم) ، والتغيرات الجوهرية التي تؤدي إلى فرط الاستثارة (على سبيل المثال ، تنظيم قنوات Na +). نموذج الصرع دون موت عصبي كبير سيسهل البحث عن أدوية جديدة مضادة للصرع.
أثناء اختبار فرضية GABA للصرع ، تم اكتشاف أن علاج الفئران VGAT-Cre ببروتوكول إشعال كهربائي خفيف أدى إلى نوبات تلقائية وكهربائية11. بشكل عام ، لا يؤدي إشعال القوارض الكهربائية إلى نوبات عفوية تحدد الصرع ، على الرغم من أنه يمكن ، في حالات الإفراط في إشعال11. تعبر فئران VGAT-Cre عن Cre recombinase تحت سيطرة جين ناقل GABA الحويصلي (VGAT) ، والذي يتم التعبير عنه على وجه التحديد في الخلايا العصبية المثبطة GABAergic. وقد وجد أن إدخال Cre عطل التعبير عن VGAT عند مستويات mRNA والبروتين ، مما يضعف انتقال GABAergic المشبكي في الحصين. وخلص إلى أن الفئران VGAT-Cre المشتعلة يمكن أن تكون مفيدة لدراسة الآليات المشاركة في تكوين الصرع ولفحص العلاجات الجديدة11. ويقدم هذا التقرير بالتفصيل الأساليب المستخدمة في وضع النموذج.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا التقرير بروتوكولا يؤدي فيه إشعال الفئران كهربائيا إلى الصرع. نظرا لأن القطب المنبه يوضع في الحصين ، فهذا صرع حوفي بؤري يصمم صرع الفص الصدغي (TLE) في المرضى. تتمثل الخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول في استخدام فئران VGAT-Cre ، والتي بسبب إدخال شريط IRES-Cre recombinase في جين Vgat ، تظهر تيارات GABA ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون جون ويليامسون على المناقشات المفيدة حول هذا البروتوكول. تم دعم هذا العمل من خلال منحة NIH / NINDS NS112549.
Materials
| 16 Channel Extracellular Differential AC Amplifier (115V/60Hz) | AD Instruments | AM3500-115-60 | Alternate EEG amplifier |
| 363/CP PLUG COLLAR, PINS SLEEVE | P1 Technologies | 363SLEEVPIN0NL | For electrode holder |
| Cable, 363-363 5CM – 100CM W/MESH 6TCM | P1 Technologies | 363363XXXXCM004 | mouse-to-commutator cable |
| CCTV cameras Qcwox HD Sony IR LED | Sony | QC-SP316 | |
| Commutator SL6C/SB (single brush) | P1 Technologies | 8BSL6CSBC0MT | formerly Plastics One, Inc. |
| Current amplifier | A-M Systems | Model 2100 | |
| Dental cement | Stoelting | 51459 | |
| Drill bits, #75, OD 0.310" LOC 130 PT | Kyocera | 105-0210.310 | |
| E363/0 SOCKET CONTACT SKEWED | P1 Technologies | 8IE3630XXXXE | pins for connector |
| iBond Self Etch glue | Kulzer | CE0197 | |
| MS363 PEDESTAL 2298 6 PIN WHITE | P1 Technologies | 8K000229801F | EEG headset connector |
| Ohmeter | Simpson | 260 | High sensitivity |
| PowerLab 16/35 and LabChart Pro | AD Instruments | PL3516/P | Alternate EEG software |
| SomnoSuite | Kent Scientific Corp. | SS-01 | anesthesia unit & RightTemp monitoring |
| Stereotactic drill and micromotor kit | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
| Stereotactic frame | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Teflon-coated wire for depth electrode, OD 0.008' | A-M Systems | 791400 | |
| VGAT-Cre mice on congenic C57BL/6J background | The Jackson Laboratory | 000664 |
References
- Lekoubou, A., Bishu, K. G., Ovbiagele, B. Nationwide trends in medical expenditures among adults with epilepsy: 2003-2014. Journal of the Neurological Sciences. 384, 113-120 (2018).
- Hauser, W. A., Hesdorffer, D. C. Epilepsy: Frequency, Causes, and Consequences. Epilepsy Foundation of America. , (1990).
- Galanopoulou, A. S., et al. Identification of new epilepsy treatments: issues in preclinical methodology. Epilepsia. 53 (3), 571-582 (2012).
- Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
- Buckmaster, P. S. Laboratory animal models of temporal lobe epilepsy. Comparative Medicine. 54 (5), 473-485 (2004).
- Levesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 45-52 (2016).
- Loscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 102 (3), 153-159 (2012).
- Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
- Dey, D., et al. A potassium leak channel silences hyperactive neurons and ameliorates status epilepticus. Epilepsia. 55 (2), 203-213 (2014).
- Straub, J., et al. Characterization of kindled VGAT-Cre mice as a new animal model of temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 61 (10), 11 (2020).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412 (2010).
- Vong, L., et al. Leptin action on GABAergic neurons prevents obesity and reduces inhibitory tone to POMC neurons. Neuron. 71 (1), 142-154 (2011).
- Vora, S. R., Camci, E. D., Cox, T. C. Postnatal ontogeny of the cranial base and craniofacial skeleton in male C57BL/6J mice: A reference standard for quantitative analysis. Frontiers in Physiology. 6, (2016).
- Lothman, E. W., Bertram, E. H., Bekenstein, J. W., Perlin, J. B. Self-sustaining limbic status epilepticus induced by ‘continuous’ hippocampal stimulation: electrographic and behavioral characteristics. Epilepsy Research. 3 (2), 107-119 (1989).
- Lothman, E. W., Williamson, J. M. Influence of electrical stimulus parameters on afterdischarge thresholds in the rat hippocampus. Epilepsy Research. 13 (3), 205-213 (1992).
- Lewczuk, E., et al. Electroencephalography and behavior patterns during experimental status epilepticus. Epilepsia. 59 (2), 369-380 (2018).
- Wenker, I. C., et al. Postictal death is associated with tonic phase apnea in a mouse model of sudden unexpected death in epilepsy. Annals of Neurology. 89 (5), 1023-1035 (2021).
- Morimoto, K., Fahnestock, M., Racine, R. J. Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain. Progress in Neurobiology. 73 (1), 1-60 (2004).
