Präparation und Implantation von Elektroden für elektrisch anzündende VGAT-Cre-Mäuse zur Erstellung eines Modells für Temporallappenepilepsie
Summary
Dieser Bericht beschreibt die Methoden zur Erstellung eines Modells der Temporallappenepilepsie, das auf dem elektrischen Anzünden transgener VGAT-Cre-Mäuse basiert. Entzündete VGAT-Cre-Mäuse können nützlich sein, um die Ursachen von Epilepsie zu bestimmen und neue Therapien zu untersuchen.
Abstract
Es wurde entdeckt, dass das elektrische Anzünden von VGAT-Cre-Mäusen zu den spontanen motorischen und elektrographischen Anfällen führte. Eine kürzlich erschienene Arbeit konzentrierte sich darauf, wie einzigartige VGAT-Cre-Mäuse bei der Entwicklung spontan wiederkehrender Anfälle (SRS) nach dem Anzünden verwendet wurden, und ein wahrscheinlicher Mechanismus – die Insertion von Cre in das VGAT-Gen – störte seine Expression und reduzierte den GABAergen Tonus. Die vorliegende Studie dehnt diese Beobachtungen auf eine größere Kohorte von Mäusen aus und konzentriert sich auf Schlüsselfragen wie die Dauer des SRS nach dem Anzünden und die Auswirkungen des Geschlechts und des Alters des Tieres. Dieser Bericht beschreibt die Protokolle für die folgenden wichtigen Schritte: Herstellung von Headsets mit Hippocampus-Tiefenelektroden zur elektrischen Stimulation und zum Lesen des Elektroenzephalogramms; Operation, um das Headset sicher am Schädel der Maus zu befestigen, damit es nicht herunterfällt; und wichtige Details des elektrischen Anzündprotokolls wie Dauer des Impulses, Frequenz des Zuges, Dauer des Zuges und Menge des eingespeisten Stroms. Das Anzündprotokoll ist insofern robust, als es bei den meisten VGAT-Cre-Mäusen zuverlässig zu Epilepsie führt und ein neues Modell zum Testen auf neuartige Antiepileptogene Medikamente darstellt.
Introduction
Epilepsie ist eine schwere neurologische Erkrankung mit erheblichen wirtschaftlichen und menschlichen Belastungen. NINDS schätzt, dass es 3 Millionen Amerikaner mit Epilepsie gibt. Etwa 0,6 Millionen dieser Patienten leiden an Temporallappenepilepsie (TLE)1. Leider scheitert die medikamentöse Behandlung von TLE bei einem Drittel der Patienten aufgrund von Unwirksamkeit, Entwicklung von Arzneimittelresistenzen oder Unverträglichkeit gegenüber Nebenwirkungen2. Es besteht eindeutig ein erheblicher Bedarf, neuartige Therapien für TLE zu entwickeln, eine Schlussfolgerung, die vom Basic Science Committee der American Epilepsy Society, der International League Against Epilepsy Working Group for Preclinical Epilepsy Drug Discovery und dem National Advisory Neurological Disorders and Stroke Councilgeteilt wird 3,4.
Aktuelle Tiermodelle der Temporallappenepilepsie verwenden entweder Chemokonvulsiva (z. B. Kainat, Pilocarpin) oder eine verlängerte elektrische Stimulation, um einen lang anhaltenden Status epilepticus zu induzieren 5,6,7. Viele Tiere sterben während des Eingriffs (10%-30% bei Ratten, bis zu 90% bei Mäusen8). Tiere, die überleben und Epilepsie entwickeln, zeigen einen ausgedehnten neuronalen Tod im gesamten Gehirn 9,10. Dieser Tod löst eine Kaskade von Reaktionen aus, beginnend mit der Aktivierung von Mikroglia, Astrozyten und infiltrierenden Monozyten. Zu den neuronalen Reaktionen gehören die Reorganisation von Schaltkreisen (z. B. das Keimen moosiger Fasern), die Geburt neuer Neuronen, die sich nicht richtig in Schaltkreise integrieren (z. B. ektopische Körnerzellen), und intrinsische Veränderungen, die zu Übererregbarkeit führen (z. B. Hochregulierung von Na+-Kanälen). Ein Epilepsiemodell ohne signifikanten neuronalen Tod wird die Suche nach neuen Antiepileptika erleichtern.
Beim Testen der GABA-Hypothese der Epilepsie wurde entdeckt, dass die Behandlung von VGAT-Cre-Mäusen mit einem milden elektrischen Anzündprotokoll zu den spontanen motorischen und elektrographischen Anfällen führte11. Im Allgemeinen führt das elektrische Anzünden von Nagetieren nicht zu spontanen Anfällen, die Epilepsie definieren, obwohl dies bei übermäßigem Anzünden der Fall sein kann11. VGAT-Cre-Mäuse exprimieren die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle des vesikulären GABA-Transporter-Gens (VGAT), das spezifisch in GABAergen inhibitorischen Neuronen exprimiert wird. Es wurde festgestellt, dass die Insertion von Cre die Expression von VGAT auf mRNA- und Proteinebene stört und somit die GABAerge synaptische Übertragung im Hippocampus beeinträchtigt. Es wurde der Schluss gezogen, dass entzündete VGAT-Cre-Mäuse nützlich sein könnten, um die Mechanismen der Epileptogenese zu untersuchen und neue Therapeutika zu untersuchen11. Der vorliegende Bericht beschreibt die Methoden, die bei der Erstellung des Modells verwendet werden, im Detail.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll, bei dem elektrisches Anzünden von Mäusen zu Epilepsie führt. Da sich die Stimulationselektrode im Hippocampus befindet, handelt es sich um eine fokale limbische Epilepsie, die die Temporallappenepilepsie (TLE) bei Patienten modelliert. Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll ist die Verwendung von VGAT-Cre-Mäusen, die aufgrund der Insertion einer IRES-Cre-Rekombinase-Kassette in das Vgat-Gen beeinträchtigte inhibitorische GABA-Ströme aufweisen11…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken John Williamson für hilfreiche Diskussionen zu diesem Protokoll. Diese Arbeit wurde durch den NIH/NINDS-Zuschuss NS112549 unterstützt.
Materials
| 16 Channel Extracellular Differential AC Amplifier (115V/60Hz) | AD Instruments | AM3500-115-60 | Alternate EEG amplifier |
| 363/CP PLUG COLLAR, PINS SLEEVE | P1 Technologies | 363SLEEVPIN0NL | For electrode holder |
| Cable, 363-363 5CM – 100CM W/MESH 6TCM | P1 Technologies | 363363XXXXCM004 | mouse-to-commutator cable |
| CCTV cameras Qcwox HD Sony IR LED | Sony | QC-SP316 | |
| Commutator SL6C/SB (single brush) | P1 Technologies | 8BSL6CSBC0MT | formerly Plastics One, Inc. |
| Current amplifier | A-M Systems | Model 2100 | |
| Dental cement | Stoelting | 51459 | |
| Drill bits, #75, OD 0.310" LOC 130 PT | Kyocera | 105-0210.310 | |
| E363/0 SOCKET CONTACT SKEWED | P1 Technologies | 8IE3630XXXXE | pins for connector |
| iBond Self Etch glue | Kulzer | CE0197 | |
| MS363 PEDESTAL 2298 6 PIN WHITE | P1 Technologies | 8K000229801F | EEG headset connector |
| Ohmeter | Simpson | 260 | High sensitivity |
| PowerLab 16/35 and LabChart Pro | AD Instruments | PL3516/P | Alternate EEG software |
| SomnoSuite | Kent Scientific Corp. | SS-01 | anesthesia unit & RightTemp monitoring |
| Stereotactic drill and micromotor kit | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
| Stereotactic frame | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Teflon-coated wire for depth electrode, OD 0.008' | A-M Systems | 791400 | |
| VGAT-Cre mice on congenic C57BL/6J background | The Jackson Laboratory | 000664 |
References
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