L’analisi iMSD (Imaging-derived mean square displacement) viene applicata ai macropinosomi per evidenziare la loro natura intrinseca in evoluzione temporale in termini di proprietà strutturali e dinamiche. I macropinosomi vengono quindi confrontati con i granuli secretori di insulina (ISG) come riferimento per strutture subcellulari con proprietà strutturali/dinamiche medie invarianti nel tempo.
Lo spostamento quadrato medio derivato dall’imaging (iMSD) viene utilizzato per affrontare le proprietà strutturali e dinamiche delle nanostrutture subcellulari, come le vescicole coinvolte nel traffico endo/esocitotico di soluti e biomolecole. iMSD si basa sull’imaging time-lapse standard, è compatibile con qualsiasi configurazione ottica e non ha bisogno di soffermarsi su singoli oggetti per estrarre traiettorie. Da ogni traccia iMSD, una tripletta unica di parametri strutturali e dinamici medi (cioè dimensione, diffusività locale, coefficiente anomalo) viene calcolata e combinata per costruire la “firma iMSD” della nanostruttura in studio.
La potenza di questo approccio è dimostrata qui con il caso esemplare dei macropinosomi. Queste vescicole si evolvono nel tempo, cambiando la loro dimensione media, il numero e le proprietà dinamiche passando dalle fasi iniziali a quelle tardive del traffico intracellulare. Come controllo, i granuli secretori di insulina (ISG) sono usati come riferimento per le strutture subcellulari che vivono in uno stato stazionario in cui le proprietà strutturali e dinamiche medie dell’intera popolazione di oggetti sono invarianti nel tempo. L’analisi iMSD evidenzia quantitativamente queste caratteristiche peculiari e apre la strada ad applicazioni simili a livello subcellulare, sia nello stato fisiologico che patologico.
Le nanostrutture subcellulari (ad esempio, vescicole endocitiche/secretorie, organelli) svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione della segnalazione cellulare1. Una corretta messa a punto delle loro caratteristiche strutturali (ad esempio, dimensioni) e / o dinamiche (ad esempio, diffusività) determina il modo in cui la cellula risponde agli stimoli interni o esterni 2,3,4. Sulla base di queste prove, non sorprende che le alterazioni di queste caratteristiche si trovino in molte condizioni patologiche. Gli esempi comprendono il ruolo dell’endocitosi mal regolata nel cancro 2,3, le alterazioni strutturali e dinamiche riscontrate a livello di ISG nelle cellule β esposte alle condizioni del diabete di tipo 25, la cattiva regolazione delle proprietà strutturali e di trasporto lisosomiale nella leucodistrofia a cellule globoidi o nella lipidosi galattosilceramide6 e disfunzionalità nella via endo-lisosomiale nelle malattie neurodegenerative (ad esempio il morbo di Alzheimer)7.
In questo contesto, i ricercatori hanno recentemente dimostrato che le prestazioni dei metodi di microscopia ottica standard possono essere migliorate regolando correttamente la risoluzione di campionamento spaziale e temporale8. Questo, a sua volta, può fornire ulteriori informazioni sui processi biologici di rilevanza. In pratica, ciò è reso possibile da un algoritmo di analisi della fluttuazione spaziotemporale, che estrae contemporaneamente le proprietà strutturali e dinamiche medie degli oggetti diffusi direttamente dalla pila standard di immagini al microscopio ottico senza alcuna necessità di conoscenze preliminari sull’oggetto biologico di interesse e di estrazione di traiettorie a singolo oggetto. Tutte queste informazioni sono racchiuse in un unico output del metodo: una traccia iMSD9 (i dettagli sulla derivazione e l’analisi della traccia iMSD sono forniti nel file supplementare 1).
Il protocollo sperimentale risultante consiste in pochi passaggi. In primo luogo, l’imaging della regione di interesse viene eseguito ad alta risoluzione temporale. Quindi, le funzioni medie di correlazione spazio-temporale vengono calcolate dalla pila di immagini. Infine, per adattamento gaussiano della serie di funzioni di correlazione, la “legge di diffusione” media viene ottenuta direttamente dall’imaging e analizzata per riconoscere la modalità di diffusione dell’oggetto. Il potenziale del metodo è già stato dimostrato per una varietà di oggetti biologici, che vanno dalle molecole alle nanoparticelle e persino interi organelli /strutture subcellulari 9,10,11,12,13,14,15.
Questo documento riporta l’applicazione dell’iMSD ai macropinosomi per evidenziare la loro natura intrinseca e irreversibile in evoluzione temporale in termini di proprietà strutturali e dinamiche medie (cioè a livello di intera popolazione). Inoltre, queste vescicole endocitiche vengono confrontate con le ISG come riferimento per le strutture subcellulari in uno “stato stazionario”, cioè uno stato in cui le proprietà strutturali / dinamiche medie dell’intera popolazione di granuli rimangono costanti in qualsiasi momento. La macropinocitosi definisce una serie di eventi iniziati dall’estesa riorganizzazione (o arruffamento) della membrana plasmatica per formare una struttura macropinocitica esterna che viene poi internalizzata16. I macropinosomi in fase iniziale sono molto simili ai fagosomi. Allo stesso tempo, possono essere distinti da altre forme di vescicole endocitiche a causa delle loro caratteristiche di grandi dimensioni, eterogeneità morfologica e mancanza di strutture proteiche-mantello.
I saggi biochimici hanno rivelato che, dopo l’internalizzazione, i macropinosomi si arricchiscono progressivamente di marcatori proteici di altre vie endocitiche, a loro volta, suggerendo che le loro identità cambiano continuamente durante il traffico17. Utilizzando anticorpi contro marcatori noti della via endosomiale, è stato dimostrato che i macropinosomi adottano progressivamente caratteristiche endosomiali classiche: diminuiscono di dimensioni, si sviluppano in strutture endocitiche tardive (ad esempio, lisosomi) o alla fine perdono la loro identità attraverso il recupero mediato dalla membrana di specifici marcatori molecolari (ad esempio, l’ordinamento delle nexine)18,19 . Lo scenario generale è che ogni singolo macropinosoma all’interno della cellula cambia irreversibilmente la sua identità strutturale e dinamica (oltre che molecolare) durante il traffico dalla membrana plasmatica al suo destino intracellulare finale. Di conseguenza, anche le proprietà strutturali/dinamiche/molecolari dell’intera popolazione di macropinosomi stanno cambiando lungo lo stesso percorso temporale. Essendo intrinsecamente sensibile alle proprietà medie dell’intera popolazione di oggetti osservati, il metodo iMSD descrive quantitativamente la “natura evolutiva” mediante la quantificazione di parametri medi chiave, cioè la diffusività locale e il coefficiente anomalo (proprietà dinamiche) e la dimensione media dei macropinosomi (proprietà strutturali) in qualsiasi fase del loro traffico intracellulare.
Per confronto, misurazioni simili sono state eseguite su una ben nota struttura intracellulare racchiusa nella membrana, l’ISG, in un modello di cellule β. Come i macropinosomi, la regolazione delle proprietà strutturali e dinamiche degli ISG, dalla loro genesi alla Rete Trans Golgi (TGN) alla loro esocitosi alla membrana plasmatica, è fondamentale per la corretta esecuzione della funzione ISG20. Tuttavia, a differenza dei macropinosomi, gli ISG vivono in uno “stato stazionario” in cui, in qualsiasi momento, tutti gli stadi funzionali/strutturali/molecolari della durata della vita dell’ISG sono simultaneamente presenti all’interno della cellula, e ciascuno è rappresentato da una specifica sottopopolazione di ISG. Ciò significa che, sebbene ogni singolo granulo si evolva irreversibilmente dalla biogenesi alla secrezione, le proprietà strutturali/dinamiche medie dell’intera popolazione di granuli dovrebbero rimanere costanti in qualsiasi momento (a meno che le condizioni dello stato stazionario non vengano modificate, ad esempio, da stimoli esterni come glucosio, colesterolo e citochine13). Ciò è confermato dall’analisi iMSD.
Le proprietà e i vantaggi dell’iMSD sono evidenti se confrontati con le tecniche disponibili per recuperare informazioni analoghe. Per le informazioni strutturali, la scelta preferita è l’analisi al microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Con questo metodo, i dettagli ultrastrutturali a risoluzione molecolare e anche oltre possono essere recuperati, anche per le nanostrutture subcellulari. Tuttavia, la peculiare risoluzione spaziale di TEM è ottenuta a scapito delle informazioni nella dimensione temporale, che è di interesse qui. Per compensare questo, i recenti progressi nelle tecnologie di imaging delle cellule vive sono di particolare interesse. Questi includono nuovi marcatori fluorescenti con prestazioni migliorate (ad esempio, luminosità e fotostabilità), procedure di etichettatura ottimizzate e rilevatori più sensibili. Inoltre, sono disponibili strumenti analitici per affrontare sia la struttura (ad esempio, “dimensione” mediante analisi basata su fasor della spettroscopia di correlazione di immagini locali, PLICS23, aggregazione / oligomerizzazione mediante analisi Number&Brightness24) che dinamica (ad esempio, legge di diffusione mediante tracciamento di singole particelle, cioè (SPT)25,26,27,28 ) parametri su scala subcellulare. Il metodo SPT consente l’accesso diretto alla traiettoria dell’oggetto e al suo MSD. Tuttavia, lo svantaggio è la necessità di una bassa densità della sonda e di etichette molto luminose e di molte traiettorie a singolo oggetto da misurare per soddisfare criteri statistici. Per quanto riguarda la risoluzione temporale della misura, le sonde inorganiche e fotostabili (ad esempio, punti quantici o nanoparticelle metalliche) possono aumentare le prestazioni SPT ma a scapito di complesse procedure di produzione ed etichettatura.
Rispetto a questi standard, il metodo iMSD qui descritto mostra alcuni vantaggi chiave. In primo luogo, questo approccio può essere utilizzato in combinazione con tag fluorescenti relativamente deboli, come le proteine fluorescenti geneticamente codificate (ad esempio, l’applicazione agli ISG). Pertanto, rispetto all’SPT, si ottiene una risoluzione temporale più elevata (utilizzando la stessa etichetta) a causa della minore quantità di fotoni richiesta8. In secondo luogo, il metodo iMSD è limitato solo dalla risoluzione temporale ma non dalla diffrazione. Infatti, nonostante il setup ottico limitato alla diffrazione utilizzato, è possibile misurare spostamenti molecolari medi anche al di sotto del limite di diffrazione, come già dimostrato per i flussi molecolari utilizzando STICS29. La risoluzione effettiva nella misurazione degli spostamenti dipende da quanto accuratamente (in termini di segnale al rumore) può essere misurata la funzione di correlazione, spiegando così perché non è limitata dalla diffrazione. Pertanto, appare chiaro che lo spostamento minimo che può essere misurato dipende dalla diffusività dell’oggetto di interesse e dalla risoluzione temporale della configurazione dell’imaging.
A questo proposito, è importante considerare che l’applicazione a nanostrutture subcellulari, come macropinosomi o granuli di insulina, con un microscopio a scansione laser è ottimale: la velocità di scansione disponibile è significativamente superiore alla dinamica dell’oggetto di interesse. In tal caso, il movimento degli oggetti durante l’acquisizione è trascurabile e la funzione di correlazione può essere approssimata da una funzione gaussiana. Infine, l’approccio iMSD può essere facilmente applicato a una vasta gamma di configurazioni di microscopia ottica commerciale basate sulla scansione raster o sull’imaging basato su telecamere ad ampio campo, senza necessità di calibrazione del sistema (necessaria solo se è necessario ottenere una stima accurata delle dimensioni delle particelle). Un parametro importante per il funzionamento del metodo è il corretto campionamento spaziale. Come regola generale, per raggiungere una convergenza soddisfacente dell’algoritmo di fitting, la dimensione minima della regione di interesse per l’imaging dovrebbe essere almeno 3 volte maggiore dello spostamento massimo di interesse.
In conclusione, il metodo iMSD richiede solo un microscopio attrezzato per un’acquisizione rapida. La struttura di interesse può essere etichettata su qualsiasi fluoroforo geneticamente codificato o organico, consentendo così l’imaging multicanale. Si prevede che l’analisi cross-iMSD sarà utilizzata nel prossimo futuro per selezionare sottopopolazioni di nanostrutture subcellulari e rivelare le loro interazioni e co-diffusione all’interno della cellula, quest’ultimo è un argomento caldo nella biofisica cellulare. Se qualche dettaglio viene perso dall’analisi iMSD, questo è certamente correlato alla grande quantità di informazioni molecolari all’interno di nanostrutture subcellulari dinamiche. Tali informazioni sono inevitabilmente mediate durante la misurazione a causa della scarsa risoluzione temporale. Teoricamente, tuttavia, non esiste un limite tecnico dovuto alla possibilità di recuperare informazioni molecolari, a condizione che si possano raggiungere velocità di acquisizione sufficienti8. A causa dei continui miglioramenti nella velocità / sensibilità del rivelatore e nelle tecnologie di imaging, si prevede che le informazioni sull’intero compartimento subcellulare e sui suoi costituenti molecolari saranno estratte da un singolo set di dati.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell’ambito del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell’Unione europea (convenzione di sovvenzione n. 866127, progetto CAPTUR3D).
100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Cell medium supplement |
C-peptide-EGFP | Plasmid | ||
DMEM High Glucose | Gibco | 31053028 | Cell medium (HeLa) |
FBS | Gibco | 10082147 | Cell medium supplement |
Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma Aldrich | 46945-100MG-F | Reagent |
HeLa | ATCC | CCL-61 | Cell Line |
Lipofectamine 2000 | TermoFisher | 11668019 | Trasfection reagent |
Lysotracker Red DND-99 | Gibco | L7528 | Reagent |
Matlab | MathWork | Software | |
Microscope-suitable cell dishes | Willco | GWSt-3522 | Petri dishes |
Olympus FV1000 | Olympus Japan | Confocal microscope | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835063 | Cell medium (INS-1E) |