Die iMSD-Analyse (Imaging-derived mean square displacement) wird auf Makropinosomen angewendet, um ihre intrinsische zeitentwickelnde Natur in Bezug auf strukturelle und dynamische Eigenschaften hervorzuheben. Macropinosomen werden dann mit insulinsekretorischen Granulaten (ISGs) als Referenz für subzelluläre Strukturen mit zeitinvarianten durchschnittlichen strukturellen/dynamischen Eigenschaften verglichen.
Imaging-derived mean square displacement (iMSD) wird verwendet, um die strukturellen und dynamischen Eigenschaften von subzellulären Nanostrukturen zu untersuchen, wie z.B. Vesikel, die am endo/exozytotischen Transport von gelösten Stoffen und Biomolekülen beteiligt sind. iMSD basiert auf Standard-Zeitraffer-Bildgebung, ist mit jedem optischen Setup kompatibel und muss nicht auf einzelnen Objekten verweilen, um Trajektorien zu extrahieren. Aus jeder iMSD-Spur wird ein eindeutiges Triplett durchschnittlicher struktureller und dynamischer Parameter (d.h. Größe, lokale Diffusivität, anomaler Koeffizient) berechnet und kombiniert, um die “iMSD-Signatur” der untersuchten Nanostruktur zu bilden.
Die Wirksamkeit dieses Ansatzes wird hier mit dem beispielhaften Fall von Makropinosomen bewiesen. Diese Vesikel entwickeln sich im Laufe der Zeit und verändern ihre durchschnittliche Größe, Anzahl und dynamischen Eigenschaften, die von den frühen bis zu den späten Stadien des intrazellulären Verkehrs reichen. Als Kontrolle werden Insulinsekretorgranula (ISGs) als Referenz für subzelluläre Strukturen verwendet, die in einem stationären Zustand leben, in dem die durchschnittlichen strukturellen und dynamischen Eigenschaften der gesamten Objektpopulation in der Zeit invariant sind. Die iMSD-Analyse hebt diese besonderen Merkmale quantitativ hervor und ebnet den Weg zu ähnlichen Anwendungen auf subzellulärer Ebene, sowohl im physiologischen als auch im pathologischen Zustand.
Subzelluläre Nanostrukturen (z.B. endozytische/sekretorische Vesikel, Organellen) spielen eine zentrale Rolle bei der zellsignalisierendenRegulation 1. Die richtige Abstimmung ihrer strukturellen (z. B. Größe) und/oder dynamischen (z. B. Diffusivität) Eigenschaften bestimmt, wie die Zelle auf interne oder externe Reize reagiert 2,3,4. Basierend auf diesen Beweisen ist es nicht verwunderlich, dass Veränderungen dieser Eigenschaften in vielen pathologischen Zuständen gefunden werden. Beispiele umfassen die Rolle der falsch regulierten Endozytose bei Krebs 2,3, die strukturellen und dynamischen Veränderungen, die auf der Ebene der ISGs in β-Zellen gefunden wurden, die Typ-2-Diabetes-Erkrankungenausgesetzt waren 5, die Fehlregulation lysosomaler Struktur- und Transporteigenschaften bei Globoidzellleukodystrophie oder Galactosylceramidlipidose6 und Dysfunktionalitäten im endo-lysosomalen Signalweg bei neurodegenerativen Erkrankungen (z. B. Alzheimer-Krankheit)7.
In diesem Zusammenhang haben Forscher kürzlich bewiesen, dass die Leistung von Standardmethoden der optischen Mikroskopie durch die richtige Abstimmung der räumlichen und zeitlichen Abtastauflösung8 verbessert werden kann. Dies wiederum kann weitere Einblicke in relevante biologische Prozesse liefern. In der Praxis wird dies durch einen Algorithmus der räumlich-zeitlichen Fluktuationsanalyse ermöglicht, der gleichzeitig die durchschnittlichen strukturellen und dynamischen Eigenschaften von diffusen Objekten direkt aus dem Standardstapel optischer Mikroskopiebilder extrahiert, ohne dass Vorkenntnisse über das biologische Objekt von Interesse und die Extraktion von Einzelobjekttrajektorien erforderlich sind. Alle diese Informationen sind in einer einzigen Ausgabe der Methode enthalten: einem iMSD-Trace9 (Details zur iMSD-Trace-Ableitung und -Analyse finden Sie in der Ergänzungsdatei 1).
Das resultierende experimentelle Protokoll besteht aus wenigen Schritten. Zunächst wird die Bildgebung der interessierenden Region mit hoher zeitlicher Auflösung durchgeführt. Anschließend werden aus dem Bildstapel durchschnittliche räumlich-zeitliche Korrelationsfunktionen berechnet. Schließlich wird durch Gaußsche Anpassung der Reihe von Korrelationsfunktionen das durchschnittliche “Diffusionsgesetz” direkt aus der Bildgebung erhalten und analysiert, um den Objektdiffusionsmodus zu erkennen. Das Potenzial der Methode wurde bereits für eine Vielzahl von biologischen Objekten nachgewiesen, die von Molekülen über Nanopartikel bis hin zu ganzen subzellulären Organellen/Strukturen reichen 9,10,11,12,13,14,15.
Dieses Papier berichtet über die Anwendung von iMSD auf Makropinosomen, um ihre intrinsische, irreversible zeitentwickelnde Natur in Bezug auf ihre durchschnittlichen (d.h. auf der gesamten Bevölkerungsebene) strukturellen und dynamischen Eigenschaften hervorzuheben. Darüber hinaus werden diese endozytären Vesikel mit ISGs als Referenz für subzelluläre Strukturen in einem “stationären Zustand” verglichen, d.h. einem Zustand, in dem die durchschnittlichen strukturellen/dynamischen Eigenschaften der gesamten Granulatpopulation zu jedem Zeitpunkt konstant bleiben. Macropinozytose definiert eine Reihe von Ereignissen, die durch die umfangreiche Reorganisation (oder Rüschen) der Plasmamembran ausgelöst werden, um eine externe makropinozytäre Struktur zu bilden, die dann internalisiertwird 16. Die gebildeten Makropinosomen im Frühstadium sind den Phagosomen sehr ähnlich. Gleichzeitig unterscheiden sie sich von anderen Formen endozytischer Vesikel durch ihre charakteristische Größe, morphologische Heterogenität und fehlende Proteinhüllenstrukturen.
Biochemische Assays zeigten, dass Makropinosomen nach der Internalisierung allmählich mit Proteinmarkern anderer endozytischer Signalwege angereichert werden, was wiederum darauf hindeutet, dass sich ihre Identität während des Handels ständig ändert17. Unter Verwendung von Antikörpern gegen bekannte Marker des Endosomenweges wurde gezeigt, dass Makropinosomen schrittweise klassische endosomale Merkmale annehmen: Sie nehmen an Größe ab, entwickeln sich zu späten endozytären Strukturen (z. B. Lysosomen) oder verlieren schließlich ihre Identität durch membranvermittelten Abruf spezifischer molekularer Marker (z. B. Sortierung von Nexinen)18,19 . Das Gesamtszenario ist, dass jedes einzelne Makropinosom innerhalb der Zelle seine strukturelle und dynamische (sowie molekulare) Identität während des Transports von der Plasmamembran zu seinem endgültigen intrazellulären Schicksal irreversibel ändert. Infolgedessen verändern sich auch die strukturellen/dynamischen/molekularen Eigenschaften der gesamten Population von Makropinosomen entlang des gleichen zeitlichen Pfades. Da die iMSD-Methode intrinsisch empfindlich auf die durchschnittlichen Eigenschaften der gesamten Population der beobachteten Objekte reagiert, bildet sie die “sich entwickelnde Natur” quantitativ durch die Quantifizierung der wichtigsten Durchschnittsparameter ab, d.h. der lokalen Diffusivität und des anomalen Koeffizienten (dynamische Eigenschaften) und der durchschnittlichen Größe der Makropinosomen (strukturelle Eigenschaft) in jedem Stadium ihres intrazellulären Verkehrs.
Zum Vergleich wurden ähnliche Messungen an einer bekannten intrazellulären membranumschlossenen Struktur, der ISG, in einem Modell von β-Zellen durchgeführt. Wie bei Makropinosomen ist die Regulation der strukturellen und dynamischen Eigenschaften von ISGs, von ihrer Entstehung im Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) bis zu ihrer Exozytose an der Plasmamembran, entscheidend für die ordnungsgemäße Ausführung der ISG-Funktion20. Im Gegensatz zu Makropinosomen leben ISGs jedoch in einem “stationären Zustand”, in dem zu jeder Zeit alle funktionellen/strukturellen/molekularen Stadien der ISG-Lebensdauer gleichzeitig in der Zelle vorhanden sind und jedes durch eine spezifische Subpopulation von ISGs repräsentiert wird. Dies bedeutet, dass, obwohl sich jedes einzelne Granulat irreversibel von der Biogenese zur Sekretion entwickelt, erwartet wird, dass die durchschnittlichen strukturellen / dynamischen Eigenschaften der gesamten Granulatpopulation zu jedem Zeitpunkt konstant bleiben (es sei denn, die stationären Zustandsbedingungen werden beispielsweise durch äußere Reize wie Glukose, Cholesterin und Zytokineverändert 13). Dies wird durch die iMSD-Analyse bestätigt.
Die Eigenschaften und Vorteile von iMSD sind im Vergleich zu den verfügbaren Techniken zum Abrufen analoger Informationen offensichtlich. Für strukturelle Informationen ist die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) -Analyse die bevorzugte Wahl. Mit dieser Methode können ultrastrukturelle Details in molekularer Auflösung und sogar darüber hinaus abgerufen werden, auch für subzelluläre Nanostrukturen. Dennoch wird die eigentümliche räumliche Auflösung von TEM auf Kosten der Informationen in der zeitlichen Dimension erreicht, was hier von Interesse ist. Um dies zu kompensieren, sind die jüngsten Fortschritte bei der Live-Cell-Bildgebungstechnologie von besonderem Interesse. Dazu gehören neue fluoreszierende Marker mit erhöhter Leistung (z. B. Helligkeit und Photostabilität), optimierte Markierungsverfahren und empfindlichere Detektoren. Darüber hinaus stehen Analysewerkzeuge zur Verfügung, um sowohl strukturelle (z. B. “Größe” durch phasorbasierte Analyse der lokalen Bildkorrelationsspektroskopie, PLICS 23, Aggregation/Oligomerisierung durch Number&Brightness-Analyse 24) als auch dynamische (z. B. Diffusionsgesetz durch Einzelpartikelverfolgung, d. H. (SPT) 25,26,27,28 ) Parameter auf der subzellulären Skala. Die SPT-Methode ermöglicht den direkten Zugriff auf die Objekttrajektorie und ihre MSD. Der Nachteil ist jedoch, dass eine geringe Dichte der Sonde und sehr helle Markierungen und viele Einzelobjekttrajektorien gemessen werden müssen, um statistische Kriterien zu erfüllen. In Bezug auf die zeitliche Auflösung der Messung können anorganische, fototaugliche Sonden (z. B. Quantenpunkte oder Metallnanopartikel) die SPT-Leistung erhöhen, jedoch auf Kosten komplexer Produktions- und Markierungsverfahren.
Im Vergleich zu diesen Standards zeigt die hier beschriebene iMSD-Methode einige entscheidende Vorteile. Erstens kann dieser Ansatz in Verbindung mit relativ schwachen fluoreszierenden Tags verwendet werden, wie z. B. genetisch kodierten fluoreszierenden Proteinen (z. B. der Anwendung auf ISGs). Somit wird im Vergleich zu SPT eine höhere zeitliche Auflösung (bei gleicher Beschriftung) aufgrund der geringeren Menge an benötigten Photonenerreicht 8. Zweitens ist die iMSD-Methode nur durch die zeitliche Auflösung, nicht aber durch die Beugung begrenzt. Tatsächlich können trotz des verwendeten beugungsbegrenzten optischen Aufbaus durchschnittliche molekulare Verschiebungen sogar unterhalb der Beugungsgrenze gemessen werden, wie bereits für molekulare Strömungen unter Verwendung von STICS29 gezeigt wurde. Die tatsächliche Auflösung bei der Messung von Verschiebungen hängt davon ab, wie genau (in Bezug auf Signal zu Rauschen) die Korrelationsfunktion gemessen werden kann, was erklärt, warum sie nicht durch Beugung begrenzt ist. Somit scheint klar zu sein, dass die minimale Verschiebung, die gemessen werden kann, von der Diffusivität des interessierenden Objekts und der zeitlichen Auflösung des Bildaufbaus abhängt.
In diesem Zusammenhang ist es wichtig zu berücksichtigen, dass die Anwendung auf subzelluläre Nanostrukturen wie Makropinosomen oder Insulingranulate mit einem Laser-Scanning-Mikroskop optimal ist: Die verfügbare Scangeschwindigkeit ist deutlich höher als die Dynamik des interessierenden Objekts. In einem solchen Fall ist die Bewegung der Objekte während der Erfassung vernachlässigbar, und die Korrelationsfunktion kann durch eine Gaußsche Funktion approximiert werden. Schließlich kann der iMSD-Ansatz leicht auf eine Vielzahl von kommerziellen optischen Mikroskopie-Setups angewendet werden, die auf Raster-Scan oder Weitfeld-Kamera-basierter Bildgebung basieren, ohne dass eine Systemkalibrierung erforderlich ist (nur erforderlich, wenn eine genaue Schätzung der Partikelgröße erreicht werden muss). Ein wichtiger Parameter für das Funktionieren der Methode ist die richtige räumliche Probenahme. Um eine zufriedenstellende Konvergenz des Anpassungsalgorithmus zu erreichen, sollte die Mindestgröße des interessierenden Bereichs für die Bildgebung in der Regel mindestens 3-mal größer sein als die maximale Verschiebung des Interesses.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die iMSD-Methode nur ein Mikroskop erfordert, das für eine schnelle Erfassung ausgestattet ist. Die interessierende Struktur kann mit jedem genetisch kodierten oder organischen Fluorophor markiert werden, wodurch eine Mehrkanal-Bildgebung ermöglicht wird. Es ist vorgesehen, dass die Cross-iMSD-Analyse in naher Zukunft verwendet wird, um Subpopulationen subzellulärer Nanostrukturen auszuwählen und ihre Wechselwirkungen und Kodiffusion innerhalb der Zelle aufzudecken, wobei letzteres ein heißes Thema in der zellulären Biophysik ist. Wenn durch die iMSD-Analyse ein Detail verloren geht, hängt dies sicherlich mit der großen Menge an molekularer Information in dynamischen subzellulären Nanostrukturen zusammen. Solche Informationen werden während der Messung aufgrund der schlechten zeitlichen Auflösung unweigerlich gemittelt. Theoretisch gibt es jedoch keine technische Grenze aufgrund der Möglichkeit, molekulare Informationen abzurufen, vorausgesetzt, dass ausreichende Erfassungsgeschwindigkeiten erreicht werdenkönnen 8. Aufgrund der kontinuierlichen Verbesserungen der Detektorgeschwindigkeit / -empfindlichkeit und der Bildgebungstechnologien ist vorgesehen, dass Informationen über das gesamte subzelluläre Kompartiment und seine molekularen Bestandteile aus einem einzigen Datensatz extrahiert werden.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union (Finanzhilfevereinbarung Nr. 866127, Projekt CAPTUR3D) gefördert.
100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Cell medium supplement |
C-peptide-EGFP | Plasmid | ||
DMEM High Glucose | Gibco | 31053028 | Cell medium (HeLa) |
FBS | Gibco | 10082147 | Cell medium supplement |
Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma Aldrich | 46945-100MG-F | Reagent |
HeLa | ATCC | CCL-61 | Cell Line |
Lipofectamine 2000 | TermoFisher | 11668019 | Trasfection reagent |
Lysotracker Red DND-99 | Gibco | L7528 | Reagent |
Matlab | MathWork | Software | |
Microscope-suitable cell dishes | Willco | GWSt-3522 | Petri dishes |
Olympus FV1000 | Olympus Japan | Confocal microscope | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835063 | Cell medium (INS-1E) |