El análisis de desplazamiento cuadrático medio (iMSD) derivado de imágenes se aplica a los macropinosomas para resaltar su naturaleza intrínseca de evolución en el tiempo en términos de propiedades estructurales y dinámicas. Los macropinosomas se comparan con los gránulos secretores de insulina (ISG) como referencia para las estructuras subcelulares con propiedades estructurales / dinámicas promedio invariantes en el tiempo.
El desplazamiento cuadrático medio derivado de imágenes (iMSD) se utiliza para abordar las propiedades estructurales y dinámicas de las nanoestructuras subcelulares, como las vesículas involucradas en el tráfico endo/exocitótico de solutos y biomoléculas. iMSD se basa en imágenes de lapso de tiempo estándar, es compatible con cualquier configuración óptica y no necesita detenerse en objetos individuales para extraer trayectorias. A partir de cada traza de iMSD, se calcula y combina un triplete único de parámetros estructurales y dinámicos promedio (es decir, tamaño, difusividad local, coeficiente anómalo) para construir la “firma iMSD” de la nanoestructura en estudio.
La potencia de este enfoque se demuestra aquí con el caso ejemplar de los macropinosomas. Estas vesículas evolucionan en el tiempo, cambiando su tamaño promedio, número y propiedades dinámicas que pasan de las primeras a las últimas etapas del tráfico intracelular. Como control, los gránulos secretores de insulina (ISG) se utilizan como referencia para las estructuras subcelulares que viven en un estado estacionario en el que las propiedades estructurales y dinámicas promedio de toda la población de objetos son invariantes en el tiempo. El análisis de iMSD destaca cuantitativamente estas características peculiares y allana el camino a aplicaciones similares a nivel subcelular, tanto en los estados fisiológicos como patológicos.
Las nanoestructuras subcelulares (por ejemplo, vesículas endocíticas/secretoras, orgánulos) desempeñan un papel fundamental en la regulación de la señalización celular1. El ajuste adecuado de sus características estructurales (por ejemplo, tamaño) y/o dinámicas (por ejemplo, difusividad) determina cómo responde la célula a los estímulos internos o externos 2,3,4. Con base en esta evidencia, no es sorprendente que las alteraciones de estas características se encuentren en muchas condiciones patológicas. Los ejemplos abarcan el papel de la endocitosis mal regulada en el cáncer 2,3, las alteraciones estructurales y dinámicas encontradas a nivel de ISG en células β expuestas a condiciones de diabetes tipo 25, la mala regulación de las propiedades estructurales y de transporte lisosomales en la leucodistrofia de células globoides o la lipidosisgalactosilceramida 6, y las disfunciones en la vía endo-lisosomal en trastornos neurodegenerativos (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer)7.
En este contexto, los investigadores han demostrado recientemente que el rendimiento de los métodos de microscopía óptica estándar puede mejorarse ajustando adecuadamente la resolución de muestreo espacial y temporal8. Esto, a su vez, puede proporcionar una mayor comprensión de los procesos biológicos de relevancia. En la práctica, esto es posible gracias a un algoritmo de análisis de fluctuación espaciotemporal, que extrae simultáneamente las propiedades estructurales y dinámicas promedio de la difusión de objetos directamente de la pila estándar de imágenes de microscopía óptica sin necesidad de conocimiento preliminar sobre el objeto biológico de interés y extracción de trayectorias de un solo objeto. Toda esta información se incluye en una única salida del método: un seguimiento iMSD9 (los detalles sobre la derivación y el análisis del seguimiento iMSD se dan en el Archivo Complementario 1).
El protocolo experimental resultante consta de unos pocos pasos. En primer lugar, la obtención de imágenes de la región de interés se realiza a alta resolución temporal. Luego, las funciones de correlación espacio-temporal promedio se calculan a partir de la pila de imágenes. Finalmente, mediante el ajuste gaussiano de la serie de funciones de correlación, la ‘ley de difusión’ promedio se obtiene directamente de las imágenes y se analiza para reconocer el modo de difusión del objeto. El potencial del método ya se demostró para una variedad de objetos biológicos, que van desde moléculas hasta nanopartículas e incluso orgánulos / estructuras subcelulares completas 9,10,11,12,13,14,15.
Este artículo informa sobre la aplicación de iMSD a macropinosomas para resaltar su naturaleza intrínseca e irreversible de evolución en el tiempo en términos de sus propiedades estructurales y dinámicas promedio (es decir, a nivel de toda la población). Además, estas vesículas endocíticas se comparan con las ISG como referencia para estructuras subcelulares en un “estado estacionario”, es decir, un estado en el que las propiedades estructurales / dinámicas promedio de toda la población de gránulos permanecen constantes en cualquier punto de tiempo. La macropinocitosis define una serie de eventos iniciados por la reorganización extensa (o agitación) de la membrana plasmática para formar una estructura macropinocítica externa que luego se internaliza16. Los macropinosomas en etapa temprana formados son muy similares a los fagosomas. Al mismo tiempo, se pueden distinguir de otras formas de vesículas endocíticas debido a su gran tamaño característico, heterogeneidad morfológica y falta de estructuras de capa de proteínas.
Los ensayos bioquímicos revelaron que, tras la internalización, los macropinosomas se enriquecen progresivamente con marcadores proteicos de otras vías endocíticas, lo que a su vez sugiere que sus identidades cambian continuamente durante el tráfico17. Utilizando anticuerpos contra marcadores conocidos de la vía endosomal, se demostró que los macropinosomas adoptan progresivamente características endosomas clásicas: disminuyen de tamaño, se convierten en estructuras endocíticas tardías (por ejemplo, lisosomas) o eventualmente pierden su identidad a través de la recuperación mediada por membrana de marcadores moleculares específicos (por ejemplo, clasificación de nexinas)18,19 . El escenario general es que cada macropinosoma dentro de la célula cambia irreversiblemente su identidad estructural y dinámica (así como molecular) durante el tráfico desde la membrana plasmática hasta su destino intracelular final. Como resultado, las propiedades estructurales/dinámicas/moleculares de toda la población de macropinosomas también están cambiando a lo largo del mismo camino temporal. Siendo intrínsecamente sensible a las propiedades promedio de toda la población de objetos observados, el método iMSD representa cuantitativamente la “naturaleza evolutiva” mediante la cuantificación de parámetros promedio clave, es decir, la difusividad local y el coeficiente anómalo (propiedades dinámicas) y el tamaño promedio de los macropinosomas (propiedad estructural) en cualquier etapa de su tráfico intracelular.
A modo de comparación, se realizaron mediciones similares en una estructura bien conocida de membrana intracelular, el ISG, en un modelo de células β. Al igual que los macropinosomas, la regulación de las propiedades estructurales y dinámicas de los ISG, desde su génesis en la Red Trans Golgi (TGN) hasta su exocitosis en la membrana plasmática, es fundamental para la correcta ejecución de la función ISG20. Sin embargo, a diferencia de los macropinosomas, los ISG viven en un “estado estacionario” en el que, en cualquier momento, todas las etapas funcionales / estructurales / moleculares de la vida útil de ISG están simultáneamente presentes dentro de la célula, y cada una está representada por una subpoblación específica de ISG. Esto significa que aunque cada gránulo evoluciona irreversiblemente de la biogénesis a la secreción, se espera que las propiedades estructurales / dinámicas promedio de toda la población de gránulos permanezcan constantes en cualquier punto de tiempo (a menos que las condiciones de estado estacionario cambien, por ejemplo, por estímulos externos como la glucosa, el colesterol y las citoquinas13). Esto se confirma mediante el análisis de iMSD.
Las propiedades y ventajas de iMSD son evidentes en comparación con las técnicas disponibles para recuperar información análoga. Para la información estructural, la opción preferida es el análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM). Mediante este método, se pueden recuperar detalles ultraestructurales a resolución molecular e incluso más allá, incluso para nanoestructuras subcelulares. Sin embargo, la peculiar resolución espacial de TEM se logra a expensas de la información en la dimensión temporal, lo cual es de interés aquí. Para compensar esto, los recientes avances en las tecnologías de imágenes de células vivas son de particular interés. Estos incluyen nuevos marcadores fluorescentes con mayores rendimientos (por ejemplo, brillo y fotoestabilidad), procedimientos de etiquetado optimizados y detectores más sensibles. Además, se dispone de herramientas analíticas para abordar tanto la estructura (por ejemplo, el “tamaño” mediante el análisis basado en fasores de la espectroscopia de correlación de imágenes locales, PLICS23, la agregación/oligomerización mediante el análisis de número y brillo24) como la dinámica (por ejemplo, la ley de difusión mediante el seguimiento de una sola partícula, es decir, (SPT)25,26,27,28 ) parámetros en la escala subcelular. El método SPT permite el acceso directo a la trayectoria del objeto y su MSD. Sin embargo, la desventaja es la necesidad de una baja densidad de la sonda y etiquetas muy brillantes y muchas trayectorias de un solo objeto que se midan para satisfacer los criterios estadísticos. Con respecto a la resolución temporal de la medición, las sondas fotoestables inorgánicas (por ejemplo, puntos cuánticos o nanopartículas metálicas) pueden aumentar el rendimiento de SPT, pero a expensas de procedimientos complejos de producción y etiquetado.
En comparación con estos estándares, el método iMSD descrito aquí muestra algunas ventajas clave. En primer lugar, este enfoque se puede utilizar junto con etiquetas fluorescentes relativamente tenues, como las proteínas fluorescentes codificadas genéticamente (por ejemplo, la aplicación a isG). Por lo tanto, en comparación con SPT, se logra una mayor resolución temporal (utilizando la misma etiqueta) debido a la menor cantidad de fotones requeridos8. En segundo lugar, el método iMSD está limitado solo por la resolución temporal, pero no por la difracción. De hecho, a pesar de la configuración óptica limitada por difracción utilizada, se pueden medir los desplazamientos moleculares promedio incluso por debajo del límite de difracción, como ya se ha demostrado para los flujos moleculares mediante el uso de STICS29. La resolución real en la medición de desplazamientos depende de la precisión (en términos de señal a ruido) con la que se puede medir la función de correlación, lo que explica por qué no está limitada por la difracción. Por lo tanto, parece claro que el desplazamiento mínimo que se puede medir depende de la difusividad del objeto de interés y la resolución temporal de la configuración de la imagen.
En este sentido, es importante considerar que la aplicación a nanoestructuras subcelulares, como macropinosomas o gránulos de insulina, con un microscopio de barrido láser es óptima: la velocidad de escaneo disponible es significativamente mayor que la dinámica del objeto de interés. En tal caso, el movimiento de los objetos durante la adquisición es insignificante, y la función de correlación puede ser aproximada por una función gaussiana. Finalmente, el enfoque iMSD se puede aplicar fácilmente a una amplia gama de configuraciones de microscopía óptica comercial basadas en escaneo ráster o imágenes basadas en cámaras de campo amplio, sin necesidad de calibración del sistema (requerida solo si se necesita lograr una estimación precisa del tamaño de partícula). Un parámetro importante para que el método funcione es el muestreo espacial adecuado. Como regla general, para alcanzar una convergencia satisfactoria del algoritmo de ajuste, el tamaño mínimo de la región de interés para la obtención de imágenes debe ser al menos 3 veces mayor que el desplazamiento máximo de interés.
En conclusión, el método iMSD solo requiere un microscopio equipado para una adquisición rápida. La estructura de interés se puede etiquetar a cualquier fluoróforo orgánico o codificado genéticamente, lo que permite imágenes multicanal. Se prevé que el análisis cruzado de iMSD se utilizará en un futuro próximo para seleccionar subpoblaciones de nanoestructuras subcelulares y revelar sus interacciones y codifusión dentro de la célula, siendo este último un tema candente en la biofísica celular. Si se pierde algún detalle por el análisis de iMSD, esto ciertamente está relacionado con la gran cantidad de información molecular dentro de las nanoestructuras subcelulares dinámicas. Dicha información se promedia inevitablemente durante la medición debido a la mala resolución temporal. Teóricamente, sin embargo, no existe un límite técnico debido a la posibilidad de recuperar información molecular, siempre que se puedan alcanzar velocidades de adquisición suficientes8. Debido a las continuas mejoras en la velocidad/sensibilidad del detector y las tecnologías de imágenes, se prevé que la información sobre todo el compartimento subcelular y sus componentes moleculares se extraerá de un único conjunto de datos.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación (CEI) en el marco del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención n.º 866127, proyecto CAPTUR3D).
100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Cell medium supplement |
C-peptide-EGFP | Plasmid | ||
DMEM High Glucose | Gibco | 31053028 | Cell medium (HeLa) |
FBS | Gibco | 10082147 | Cell medium supplement |
Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma Aldrich | 46945-100MG-F | Reagent |
HeLa | ATCC | CCL-61 | Cell Line |
Lipofectamine 2000 | TermoFisher | 11668019 | Trasfection reagent |
Lysotracker Red DND-99 | Gibco | L7528 | Reagent |
Matlab | MathWork | Software | |
Microscope-suitable cell dishes | Willco | GWSt-3522 | Petri dishes |
Olympus FV1000 | Olympus Japan | Confocal microscope | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835063 | Cell medium (INS-1E) |