Анализ среднего квадратного смещения (iMSD) применяется к макропиносомам, чтобы подчеркнуть их внутреннюю эволюционирующую во времени природу с точки зрения структурных и динамических свойств. Затем макропиносомы сравнивают с секреторными гранулами инсулина (ISG) в качестве эталона для субклеточных структур со средними структурными/динамическими свойствами, инвариантными во времени.
Среднее квадратное смещение, полученное из визуализации (iMSD), используется для решения структурных и динамических свойств субклеточных наноструктур, таких как везикулы, участвующие в эндо/экзоцитотическом трафике растворенных веществ и биомолекул. iMSD опирается на стандартную покадровую съемку, совместим с любой оптической установкой и не нуждается в остановке на отдельных объектах для извлечения траекторий. Из каждого следа iMSD рассчитывается уникальный триплет средних структурных и динамических параметров (т.е. размер, локальная диффузия, аномальный коэффициент) для построения «сигнатуры iMSD» исследуемой наноструктуры.
Эффективность этого подхода доказана здесь на примере макропиносом. Эти везикулы развиваются во времени, изменяя свой средний размер, количество и динамические свойства, переходя от ранних до поздних стадий внутриклеточного трафика. В качестве контроля в качестве ориентира для субклеточных структур, живущих в стационарном состоянии, при котором средние структурные и динамические свойства всей совокупности объектов инвариантны во времени. Анализ iMSD выделяет эти специфические особенности количественно и прокладывает путь к аналогичным применениям на субклеточном уровне, как в физиологических, так и в патологических состояниях.
Субклеточные наноструктуры (например, эндоцитарные/секреторные везикулы, органеллы) играют ключевую роль в клеточной сигнальной регуляции1. Правильная настройка их структурных (например, размер) и/или динамических (например, диффузионность) характеристик определяет, как клетка реагирует на внутренние или внешние раздражители 2,3,4. Исходя из этих доказательств, неудивительно, что изменения этих характеристик обнаруживаются при многих патологических состояниях. Примеры охватывают роль неправильно регулированного эндоцитоза при раке 2,3, структурные и динамические изменения, обнаруженные на уровне ISG в β-клетках, подвергшихся воздействию диабета 2 типа5, неправильную регуляцию лизосомальных структурных и транспортных свойств при глобоидно-клеточной лейкодистрофии или галактозилцерамидном липидозе6 и дисфункции в эндо-лизосомальном пути при нейродегенеративных расстройствах (например, болезнь Альцгеймера)7.
В этом контексте исследователи недавно доказали, что производительность стандартных методов оптической микроскопии может быть улучшена путем правильной настройки пространственного и временного разрешения выборки8. Это, в свою очередь, может дать дальнейшее понимание биологических процессов, имеющих отношение к делу. На практике это стало возможным благодаря алгоритму пространственно-временного флуктуационного анализа, который одновременно извлекает средние структурные и динамические свойства диффузных объектов непосредственно из стандартного стека изображений оптической микроскопии без необходимости предварительных знаний о интересующем биологическом объекте и извлечения однообъектных траекторий. Вся эта информация заключена в один вывод метода: iMSD trace9 (подробности о выводе и анализе трассировки iMSD приведены в дополнительном файле 1).
Полученный экспериментальный протокол состоит из нескольких шагов. Во-первых, визуализация интересующей области выполняется с высоким временным разрешением. Затем из стека изображений вычисляются средние пространственно-временные корреляционные функции. Наконец, путем гауссовского соответствия ряда корреляционных функций средний «закон диффузии» получается непосредственно из визуализации и анализируется для распознавания режима диффузии объекта. Потенциал метода уже был доказан для различных биологических объектов, начиная от молекул и заканчивая наночастицами и даже целыми субклеточными органеллами/структурами 9,10,11,12,13,14,15.
В данной статье сообщается о применении iMSD к макропиносомам, чтобы подчеркнуть их внутреннюю, необратимую эволюционирующую во времени природу с точки зрения их средних (т.е. на уровне всей популяции) структурных и динамических свойств. Кроме того, эти эндоцитарные везикулы сравниваются с ISG в качестве эталона для субклеточных структур в «стационарном состоянии», то есть состоянии, в котором средние структурные/динамические свойства всей популяции гранул остаются постоянными в любой момент времени. Макропиноцитоз определяет ряд событий, инициированных обширной реорганизацией (или взъерошением) плазматической мембраны с образованием внешней макропиноцитарной структуры, которая затеминтернализуется 16. Сформированные макропиносомы ранней стадии очень похожи на фагосомы. В то же время их можно отличить от других форм эндоцитарных пузырьков благодаря характерным большим размерам, морфологической неоднородности и отсутствию белково-покровных структур.
Биохимические анализы показали, что при интернализации макропиносомы постепенно обогащаются белковыми маркерами других эндоцитарных путей, что, в свою очередь, свидетельствует о том, что их идентичность постоянно меняется во время торговли17. Используя антитела против известных маркеров эндосомального пути, было продемонстрировано, что макропиносомы постепенно перенимают классические эндосомальные особенности: они уменьшаются в размерах, развиваются в поздние эндоцитарные структуры (например, лизосомы) или в конечном итоге теряют свою идентичность посредством мембранно-опосредованного извлечения специфических молекулярных маркеров (например, сортировка нексинов)18,19 . Общий сценарий заключается в том, что каждая макропиносома в клетке необратимо изменяет свою структурную и динамическую (а также молекулярную) идентичность во время транспортировки от плазматической мембраны к ее окончательной внутриклеточной судьбе. В результате структурные/динамические/молекулярные свойства всей популяции макропиносом также изменяются по тому же временному пути. Будучи внутренне чувствительным к средним свойствам всей совокупности наблюдаемых объектов, метод iMSD количественно изображает «эволюционирующую природу» путем количественной оценки ключевых средних параметров, т.е. локальной диффузии и аномального коэффициента (динамических свойств) и среднего размера макропиносом (структурного свойства) на любой стадии их внутриклеточного трафика.
Для сравнения, аналогичные измерения были выполнены на хорошо известной внутриклеточной мембранно-замкнутой структуре, ISG, в модели β-клеток. Как и макропиносомы, регуляция структурных и динамических свойств ISG, от их генезиса в Сети Транс Гольджи (TGN) до их экзоцитоза в плазматической мембране, имеет решающее значение для правильного выполнения функцииISG 20. Однако, в отличие от макропиносом, ISG живут в «стационарном состоянии», в котором в любое время все функциональные/структурные/молекулярные стадии продолжительности жизни ISG одновременно присутствуют внутри клетки, и каждая из них представлена определенной субпопуляцией ISG. Это означает, что, хотя каждая отдельная гранула необратимо эволюционирует от биогенеза к секреции, средние структурные/динамические свойства всей популяции гранул, как ожидается, останутся постоянными в любой момент времени (если условия стационарного состояния не изменяются, например, внешними стимулами, такими как глюкоза, холестерин и цитокины13). Это подтверждается анализом iMSD.
Свойства и преимущества iMSD очевидны по сравнению с методами, доступными для получения аналогичной информации. Для структурной информации предпочтительным выбором является анализ просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ). С помощью этого метода ультраструктурные детали с молекулярным разрешением и даже за его пределами могут быть извлечены, даже для субклеточных наноструктур. Тем не менее, своеобразное пространственное разрешение ТЕА достигается за счет информации во временном измерении, что представляет здесь интерес. Чтобы компенсировать это, особый интерес представляют последние достижения в области технологий визуализации живых клеток. К ним относятся новые флуоресцентные маркеры с повышенными характеристиками (например, яркость и фотостабильность), оптимизированные процедуры маркировки и более чувствительные детекторы. Кроме того, доступны аналитические инструменты для решения как структурных (например, «размер» путем фазорного анализа локальной корреляционной спектроскопии изображений, PLICS23, агрегации/олигомеризации с помощью анализа чисел и яркости24), так и динамических (например, закон диффузии путем отслеживания одной частицы, т.е. (SPT)25,26,27,28 ) параметры по субклеточной шкале. Метод ППП обеспечивает прямой доступ к траектории объекта и его MSD. Однако недостатком является необходимость измерения низкой плотности зонда и очень ярких меток и множества траекторий одного объекта для удовлетворения статистических критериев. Что касается временного разрешения измерения, то неорганические, фотостабильные зонды (например, квантовые точки или наночастицы металлов) могут повысить производительность SPT, но за счет сложных процедур производства и маркировки.
По сравнению с этими стандартами метод iMSD, описанный здесь, показывает некоторые ключевые преимущества. Во-первых, этот подход может быть использован в сочетании с относительно тусклыми флуоресцентными метками, такими как генетически закодированные флуоресцентные белки (например, применение к ISG). Таким образом, по сравнению с SPT достигается более высокое временное разрешение (с использованием той же метки) за счет меньшего количества фотонов, требуемого8. Во-вторых, метод iMSD ограничен только временным разрешением, но не дифракцией. Фактически, несмотря на используемую оптическую установку с дифракционным ограничением, средние молекулярные смещения даже ниже дифракционного предела могут быть измерены, как уже было продемонстрировано для молекулярных потоков с помощью STICS29. Фактическое разрешение при измерении перемещений зависит от того, насколько точно (с точки зрения сигнал-шум) может быть измерена корреляционная функция, тем самым объясняя, почему она не ограничена дифракцией. Таким образом, представляется очевидным, что минимальное смещение, которое может быть измерено, зависит от диффузии интересующего объекта и временного разрешения установки визуализации.
В связи с этим важно учитывать, что применение к субклеточным наноструктурам, таким как макропиносомы или гранулы инсулина, с лазерным сканирующим микроскопом является оптимальным: доступная скорость сканирования значительно превышает динамику интересующего объекта. В таком случае движение объектов при приобретении ничтожно мало, а корреляционная функция может быть аппроксимирована гауссовской функцией. Наконец, подход iMSD может быть легко применен к широкому спектру коммерческих оптических микроскопических установок, основанных на растровом сканировании или широкоугольном изображении на основе камеры, без необходимости калибровки системы (требуется только в том случае, если необходимо достичь точной оценки размера частиц). Важным параметром для работы метода является правильная пространственная выборка. Как правило, для достижения удовлетворительной сходимости алгоритма подгонки минимальный размер области, представляющей интерес для визуализации, должен быть как минимум в 3 раза больше максимального смещения интереса.
В заключение, метод iMSD требует только микроскопа, оснащенного для быстрого получения. Интересующая структура может быть помечена любым генетически закодированным или органическим флуорофором, что обеспечивает многоканальную визуализацию. Предполагается, что кросс-iMSD-анализ будет использоваться в ближайшем будущем для отбора субпопуляций субклеточных наноструктур и выявления их взаимодействий и кодиффузии внутри клетки, причем последняя является горячей темой в клеточной биофизике. Если какие-либо детали теряются при анализе iMSD, это, безусловно, связано с большим количеством молекулярной информации в динамических субклеточных наноструктурах. Такая информация неизбежно уселяется во время измерения из-за плохого временного разрешения. Теоретически, однако, не существует технического ограничения из-за возможности извлечения молекулярной информации при условии, что могут быть достигнуты достаточные скорости сбора8. В связи с постоянным улучшением скорости/чувствительности детектора и технологий визуализации предполагается, что информация обо всем субклеточном компартменте и его молекулярных составляющих будет извлекаться из одного набора данных.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа получила финансирование от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках Программы исследований и инноваций Европейского союза Horizon 2020 (грантовое соглашение No 866127, проект CAPTUR3D).
100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Cell medium supplement |
C-peptide-EGFP | Plasmid | ||
DMEM High Glucose | Gibco | 31053028 | Cell medium (HeLa) |
FBS | Gibco | 10082147 | Cell medium supplement |
Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma Aldrich | 46945-100MG-F | Reagent |
HeLa | ATCC | CCL-61 | Cell Line |
Lipofectamine 2000 | TermoFisher | 11668019 | Trasfection reagent |
Lysotracker Red DND-99 | Gibco | L7528 | Reagent |
Matlab | MathWork | Software | |
Microscope-suitable cell dishes | Willco | GWSt-3522 | Petri dishes |
Olympus FV1000 | Olympus Japan | Confocal microscope | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835063 | Cell medium (INS-1E) |